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超氧陰離子清除能力試劑盒

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     意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基,可攻擊生物大分子,如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等,使其交鏈或者斷裂,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞,與機(jī)體衰老和病變有很密切的關(guān)系,清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。

測定原理

AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子,鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2,NO2對氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物,530nm有特征吸收峰,樣品對超氧陰離子的清除能力與530nm的吸光值呈負(fù)相關(guān)。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加12mL蒸餾水充分溶解。

試劑三:液體15mL×1瓶,4℃保存。

試劑四:液體15mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑五:液體15mL×1瓶,4℃避光保存。

樣品處理

1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。

2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min;然后4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。

3. 培養(yǎng)液或其它液體:直接檢測。

4. 粉劑藥物可配制成相同濃度,比如1mg/mL

測定操作

 

對照管

測定管

試劑一(μL

40

40

試劑二(μL

160

160

H2OμL

100

 

充分混勻,25℃反應(yīng)1min

樣品(μL

 

100

試劑三(μL

200

200

充分混勻,37℃反應(yīng)30min

試劑四(μL

200

200

試劑五(μL

200

200

充分混勻,37℃顯色20min,于1mL玻璃比色皿,在530nm處測定對照管和測定管的吸光值,分別記為A對照管和A測定管。

注意:對照管只需測定一次。

計算公式

 

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