注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
多功能氧化酶又稱混合功能氧化酶,可產(chǎn)生降解反應,可使原化學物質(zhì)變?yōu)榈投镜幕驘o毒的物質(zhì)從體內(nèi)排出;還可產(chǎn)生激活反應,可使原化學物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有親電子性質(zhì),導致毒性增強,成為致突變物或終致癌物。近年來對混合功能氧化酶系與外源性化學物質(zhì)相互作用的深入研究,對于從分子生物學水平上進一步了解外源性化學物質(zhì)的毒作用具有重要意義。
測定原理:
MFO催化對硝基苯甲醚產(chǎn)生對硝基苯酚,在400nm下有特征吸光值。
自備用品:
分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水、氯仿。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體30mL×1瓶,4℃避光保存;
試劑二:粉劑×3管,-20℃保存;臨用前取一管加入2mL水溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用。
試劑三:液體30mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體80mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提。
按照組織質(zhì)量(g):提取液(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、 分光光度計預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至400nm,蒸餾水調(diào)零。
2、在10mL管中依次加入如下試劑
試劑名稱(μL) | 測定 | 空白 |
試劑一 | 500 | 500 |
試劑二 | 100 | 100 |
提取液 | 400 | 900 |
樣本 | 500 |
|
混勻,37℃水浴30min | ||
試劑三 | 500 | 500 |
分別加入2.5mL氯仿,充分混勻萃取,靜置10min,取下層氯仿層1.5mL至新的管中。再加入試劑四1.5mL,充分混勻萃取,取上層水相1mL于1mL玻璃比色皿中,400nm下測定吸光值A測定與A空白,△A=A測定-A空白?瞻坠苤恍铚y一管。
MFO活性計算:
標準曲線:y = 0.0238x + 0.0021,R2 = 0.9997;y,吸光度;x,標準品濃度,單位nmol/mL。
(1)按樣本質(zhì)量計算
單位定義:每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
MFO(nmol/min/g 鮮重)=(△A-0.0021)÷0.0238×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=4.2×(△A-0.0021)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
MFO(nmol/min/mg prot)=(△A-0.0021)÷0.0238×V總÷(V樣×Cpr)÷T
=4.2×(△A-0.0021)÷Cpr
V總:最終萃取液體積,1.5 mL;V樣:反應中樣品體積,500μL;T:反應時間,30min;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL。