注 意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能,對生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。
測定原理:
巰基基團(tuán)與5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng),生成黃色化合物,在412nm處有最大吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品:
天平、研缽、可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、1mL玻璃比色皿、乙醇和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體50 mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體40 mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。
樣品的制備:
1. 按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 血清,培養(yǎng)液:取0.1mL樣本,加入0.4mL提取液,混勻,室溫靜置10min, 然后8000g,4℃離心10min,
3. 取上清,置冰上待測。
操作步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至412nm,雙蒸水調(diào)零。
2、 操作表
在1mL玻璃比色皿中加入如下試劑
| 對照管 | 測定管 |
樣品(μL) | 200 | 200 |
試劑一(μL) | 750 | 750 |
試劑二(μL) |
| 50 |
乙醇(μL) | 50 |
|
混勻,25℃靜置10min, 測定412nm吸光值,ΔA=A測定-A對照。每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對照管。 |
計(jì)算公式:
非蛋白巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =3.6222 x- 0.0037,R2 = 1,x為標(biāo)品濃度,單位μmol/mL, y為吸光度ΔA。
1. 組織:
(1)按樣本重量計(jì)算
非蛋白巰基含量(μmol/g 鮮重)=(ΔA+0.0037)÷3.6222 ×V樣總÷W
=0.276×(ΔA+0.0037)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算
非蛋白巰基含量(μmol/mg prot)=(ΔA+0.0037)÷3.6222×V樣總÷Cpr
=0.276×(ΔA+0.0037)÷Cpr
2. 血清、培養(yǎng)液:
非蛋白巰基含量(μmol/L)=(ΔA+0.0037)÷3.6222×5 ×103
=1380×(ΔA+0.0037)
V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g ;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;5:血清,培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù);103 :1mmol/L=103μmol/ L