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天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase)活性測定試劑盒

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     意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

天冬酰胺合成酶是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類氨基轉(zhuǎn)移酶,催化谷氨酞胺的氨基向天冬氨酸轉(zhuǎn)移。當(dāng)植物處于氨毒時天冬酞胺的形成是一種解毒反應(yīng)。


測定原理:

AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨,利用奈氏試劑檢測氨增加的速率,即可計算其酶活性。

需自備儀器和用品:

臺式離心機(jī)、可見分光光度計、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。


試劑組成和配制:

試劑一×1瓶,60 mL4 ℃保存;

試劑二×1瓶,20 mL4 ℃保存;

試劑三×1瓶,30 mL,常溫保存;

試劑四×1瓶,10 mL,常溫保存;

試劑五×1瓶,6 mL,常溫保存;

試劑六×1瓶,6 mL,常溫避光保存。


粗酶液提。

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。


測定步驟:

1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至420nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定(在EP中加入下列試劑):

試劑名稱(uL

測定管

對照管

樣本

25

 

蒸餾水

 

25

試劑一

100

100

試劑二

400

400

 

 

混勻,37℃水浴1 小時

試劑三

525

525

混勻,8000 g,25℃離心10 min;取上清液,在EP管中加入下列試劑

         上清液

650

650

試劑四

150

150

試劑五

100

100

試劑六

100

100

混勻,室溫靜置15min420nm處讀取吸光值A,計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管

注意:試劑六如出現(xiàn)沉淀,靜置后取上清使用。

 

計算:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.662x -0.0434;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y吸光值A。。

1、血清(漿)AS活性

單位定義:每mL血清(漿)小時產(chǎn)生1μg 定義為一個酶活力單位。

ASμg/h/mL)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷V÷T=31.722×(ΔA+0.0434)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞AS活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1μg 定義為一個酶活力單位。

AS活力(μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(V×Cpr)÷T =31.722×(ΔA+0.0434) ÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每小時產(chǎn)生1μg定義為一個酶活力單位。

AS活力(μg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(W× V÷V樣總T =31.722×(ΔA +0.0434) ÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生1μg 定義為一個酶活力單位。

AS活力(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.0634×(ΔA+0.0434)

T:反應(yīng)時間,1h V反總:反應(yīng)體系總體積0.525mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積0.025mL;V樣總:提取液體積,1mL;Cpr樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣質(zhì)量, g500細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500

 

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