注 意 : 正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一,膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等,因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
測定原理:
樣品經(jīng)酸水解產(chǎn)生游離的HYP,進(jìn)一步被氯胺T氧化,氧化產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng),產(chǎn)生紅色化合物,在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值,可計(jì)算HYP含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、烘箱、玻璃管、離心機(jī)、水浴鍋、可見分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
試劑組成和配制:
組織提取液:6mol/L鹽酸,自備。濃鹽酸:H2O(V/V)= 1:1,室溫保存。
細(xì)胞提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。
羥脯氨酸提取:
1. 組織:稱取約0.5g樣品于玻璃管,加入5mL的組織提取液,置于110℃烘箱,水解6至12小時(shí),用提取液定容至5mL,12000g,25℃,離心20min,取上清待測。
2. 細(xì)胞:取500萬個(gè)細(xì)胞,加入2mL的細(xì)胞提取液,于高壓消毒器中15磅保持30min,自然降壓后待測。
3. 血清游離羥脯氨酸提。喝0.2mL血清,加入1mL無水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀,8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個(gè)EP管,氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.4mL50%異丙醇,充分溶解混勻待測。
測定操作表:
| 空白管 | 測定管 |
樣本(µL) |
| 200 |
試劑一(µL) | 200 | 200 |
混勻,室溫靜置20min | ||
試劑二(µL) | 200 | 200 |
H2O(µL) | 600 | 400 |
混勻,60℃,20min,取出后25℃靜置15 min,蒸餾水調(diào)零,1mL玻璃比色皿中檢測560nm處吸光值。ΔA=A測定-A對(duì)照 |
羥脯氨酸含量計(jì)算公式:
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991
(1)按組織計(jì)算
HYP含量(mg/g 鮮重)=(ΔA -0.0251)÷ 64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.385×(ΔA -0.0251)÷W
(2)按細(xì)胞計(jì)算
HYP含量(mg/104 cell)=(ΔA -0.0251)÷ 64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))
= 0.154×(ΔA -0.0251)÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))
(3)按液體體積計(jì)算
HYP含量(mg/mL)=(ΔA -0.0251)÷ 64.875×V反總÷V樣×2
= 0.154×(ΔA -0.0251)
V反總:反應(yīng)總體積,1mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.2mL;V樣總:加入提取液體積, mL; W:樣品質(zhì)量,g;2,血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。
注意事項(xiàng):
1、 OD值大于0.8,樣品適當(dāng)稀釋再測定,注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。
2、 試劑有一定的毒性,請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施,防止吸入或與皮膚接觸。
3、 最低檢出限為3.8mg/L。