描述:RAPA3G DNA 聚合酶為經(jīng)電子重構(gòu)架的第三代 Taq DNA 聚合酶,第三代 DNA 聚合酶具有高度的雜質(zhì)耐受性、 長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力、高擴(kuò)增成功率、高產(chǎn)量,這些特點(diǎn)使得 RAPA3G 系列產(chǎn)品可用于粗制樣品的直接擴(kuò)增,無需核酸純 化步驟。 該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、 5’-3’的外切 酶活性、3’-5’的外切酶活性,產(chǎn)物部分帶有”A“尾巴,部 分為平末端,因此產(chǎn)物可用于 TA 克隆或平端克隆。
特點(diǎn)和用途:
(1)高雜質(zhì)耐受性:該 PCR Mix 可直接使用多糖多酚含量 極高的葉片等材料進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,無需基因組提取。
(2) 高效的快速 DNA 釋放劑:盡管該 PCR Mix 可以直接 使用葉片進(jìn)行擴(kuò)增,但我們?nèi)匀煌扑]采用 DNA 釋放劑進(jìn)行 樣本的快速前處理(約需要 5min,可高通量操作)。DNA 釋 放劑的前處理, 使得制備的 DNA 模板可以進(jìn)行多次、多基 因擴(kuò)增, 并長(zhǎng)期保存植物 DNA,經(jīng) DNA 釋放劑處理的樣本, 在室溫條件下放置 1 個(gè)月, 無任何后續(xù)影響,-20 可長(zhǎng)期保 存。
(3) 快速 PCR:該酶具有 6kb/min 以上的擴(kuò)增速度,可 顯著的縮短 PCR 的擴(kuò)增時(shí)間,在常規(guī)測(cè)試條件下,10s 的 延伸時(shí)間可完成 1kb 的基因組 DNA 擴(kuò)增。
(4) 粗制樣品的擴(kuò)增能力:擴(kuò)增能力>1.7kb。
(5) 高保真性能:該制品包含一定比例的 RAPA HiFi 超保 真 DNA 聚合酶, 因此其具有一定的保真性能(經(jīng)藍(lán)白斑測(cè) 試,其保真性能約為 Taq DNA 聚合酶的56 倍)。
(6) 熱啟動(dòng), 防止非特異性擴(kuò)增: RAPA3G 系列產(chǎn)品均采 用 HaiGene 專有的熱啟動(dòng)技術(shù),確保 50 度以下完全無活性, 僅有 95 度加熱 5min 以后才能恢復(fù)其活性,因此可最大限度 的提高擴(kuò)增的特異性, 減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。
包裝:
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 快速 DNA 釋放劑 A 快速 DNA 釋放劑 B | 1mlX2 20 ml 20 ml |
注意:2×RAPA3G PCR Mix (with Dye)制品可單獨(dú)訂購(gòu),貨 號(hào), A0607。
儲(chǔ)存: 長(zhǎng)期儲(chǔ)存置于-20°C 以下,可保存 2 年;短期使用置 于 4°C (3 個(gè)月)保存。
使用方法
1. DNA 釋放
(1)采用加熱法:取 2-3mm 直徑葉片(白 Tip 頭上沿大小)、 1- 10mg 果實(shí)等材料, 放入到 0.2ml EP 管中, 加入 50 pl 快 速 DNA 釋放劑 A,于 PCR 儀中98°C 加熱 5min,加熱完畢 后加入 50 pl 快速 DNA 釋放劑 B,混合均勻,即可使用。
(2) 采用鋼珠研磨法:取 2-3mm 直徑葉片、 1- 10mg 果實(shí) 等材料, 放入到 2ml EP 管中,加入 250 pl 快速 DNA 釋放 劑 A 和 2-3 粒鋼珠,研磨 1-2min 成漿體裝。 研磨完畢后加 入 250 pl 快速 DNA 釋放劑 B,混合均勻,即可使用。
2. 按下表配制 PCR 反應(yīng)體系并混合均勻: 2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 25 pl
上游引物(10 pM)
下游引物(10 pM)
步驟 1 制備的模板 DNA 2 pl
ddH2O
注意:當(dāng)擴(kuò)增片段>5kb 時(shí),引物用量調(diào)整為 0.25-0.5pl。
3. PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)
循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 95°C | 5min |
| 95°C | 20s |
25-40 Cycles | 50~60°C 72°C | 20s 4-6kb/min |
末延伸 | 72°C | 2min |
請(qǐng)注意:(1) 該制品為熱啟動(dòng)制品預(yù)變性步驟 5min 不可縮 短,否則 DNA 聚合酶無法恢復(fù)活性。(2) 當(dāng)擴(kuò)增片段<1kb 時(shí), 延伸時(shí)間使用 15s;擴(kuò)增片段 1-2kb 時(shí),延伸時(shí)間使用 45s ,擴(kuò)增片段 2-3kb 時(shí),延伸時(shí)間使用 1min ,當(dāng)擴(kuò)增片 段>3kb 時(shí),請(qǐng)按照 2kb/min 的延伸時(shí)間進(jìn)行設(shè)置。(3)盡管 該酶具有 6kb/min 的延伸速度, 但按照 2kb/min 設(shè)置延伸時(shí) 間的條件下,能獲得最高的產(chǎn)量。
3. 注意事項(xiàng): (1) 當(dāng)模板 GC 含量>70%時(shí),請(qǐng)?zhí)砑?/span>
5× Q-Solution (Cat. No.: A3002) 。(2)當(dāng)采用全血、血漿等 蛋白含量極高的樣本時(shí), 擴(kuò)增完畢后可能會(huì)有變性的蛋白沉
淀,請(qǐng)離心后再進(jìn)行點(diǎn)樣和電泳。