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多重PCR擴(kuò)增PCR Mix——2×RAPA3G Multiplex PCR Mix

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Multiplex PCR又稱多重PCR,是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物,同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng),已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病診斷等多個領(lǐng)域,特別適用于微量樣本的多位點(diǎn)檢測。
RAPA3G Multiplex PCR Mix多重PCR Mix)使用具有超強(qiáng)擴(kuò)增性能的熱啟動RAPA3G DNA聚合酶和優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)緩沖液,使其可有效擴(kuò)增20重以上的PCR,具有極高的靈敏度,最大程度上減少了反應(yīng)體系優(yōu)化步驟。

特征

  • RAPA3G DNA聚合酶,超強(qiáng)擴(kuò)增性能,極高抗雜質(zhì)能力
  • 完全封閉的熱啟動特性,50℃以下100%無活性
  • 優(yōu)化的反應(yīng)緩沖體系,避免非特異性擴(kuò)增
  • 高靈敏度,有效擴(kuò)增0.1ng的人基因組DNA(20重)

儲存

長期儲存置于-20°C以下,可保存2年,避免反復(fù)凍融;短期使用置于4°C(3個月)保存,一經(jīng)融化后請放置于4°C,勿再凍存。

反應(yīng)實(shí)例

1. 應(yīng)用2xRAPA3G Multiplex PCR Mix進(jìn)行20重PCR擴(kuò)增;用0.1ng、1ng、10ng和100ng的人基因組分別擴(kuò)增30和35個循環(huán),4%的瓊脂糖凝膠,80V電泳300min,如圖所示該Multiplex PCR Mix對不同量的模板具有很好的兼容性,且靈敏度可至0.1ng。
2.應(yīng)用2xRAPA3G Multiplex PCR Mix分別用不同的模板進(jìn)行20重PCR擴(kuò)增,泳道1-5分別為:1μl抗凝全血分離的白細(xì)胞(相當(dāng)于5μl抗凝全血)、1μl抗凝全血、1μl血清、1μl含50ng human gDNA的血清和50ng human gDNA, 結(jié)果顯示RAPA3G Multiplex PCR Mix具有較強(qiáng)的抗雜質(zhì)能力,對于全血等樣品也能較好的擴(kuò)增。
3.應(yīng)用2xRAPA3G Multiplex PCR Mix和Supplier A和 Supplier B的同類產(chǎn)品進(jìn)行15重PCR擴(kuò)增,比較如下圖,可見RAPA3G Multiplex PCR Mix擴(kuò)增性能較其他同類產(chǎn)品具有卓越的擴(kuò)增性能。

注意事項(xiàng)

1.當(dāng)模板GC含量>70%時,請?zhí)砑?×Q-Solution(Cat. No.: A3002)。
2.推薦引物設(shè)計(jì)原則:引物長度保持在22 - 30 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物長度在2kb以下,GC含量50% - 60%,盡量減少各引物之間TM的差值。
3.檢測單引物特異性:多重PCR反應(yīng)前,應(yīng)對設(shè)計(jì)的引物逐一擴(kuò)增,以確定是否有非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率。
4.引物推薦使用濃度:推薦擴(kuò)增片段<300bp每條引物的反應(yīng)終濃度為0.2-0.3μM,擴(kuò)增片段>300bp每條引物的反應(yīng)終濃度為0.05-0.15μM,如某些目標(biāo)片段產(chǎn)量偏低或偏高,可適度調(diào)整其對應(yīng)引物使用量以優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果。
5.反應(yīng)前需將引物制成10×Primer Mix:預(yù)先混合所有擴(kuò)增引物,使每條引物濃度為0.5 ~3 μM。

常見問題及解決方案

1. 擴(kuò)增產(chǎn)物少或沒有擴(kuò)增。
(1) 降低退火溫度(每個梯度降低1℃)。
(2) 增加模板量
(3) 增加PCR循環(huán)數(shù)。
(4) 增加退火時間為90 sec,必要時可延長退火時間至3 min。
(5) 增加引物使用量。
2. 存在非特異性擴(kuò)增。
(1) 減少循環(huán)數(shù),提高退火溫度(每個梯度降低1℃)。
(2) 減少引物使用量。
(3) 重新設(shè)計(jì)引物。
3. 電泳時條帶模糊。
(1) 減少循環(huán)數(shù)(每次減少3個循環(huán))。
(2) 減少起始模板量。
(3) 延長徹底延伸步驟時間至15 - 30 min。
(4) 減少退火時間。
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