T7 RNA 聚合酶對(duì)T7噬菌體啟動(dòng)子具有高度的特異性,并可以其作為啟動(dòng)子,DNA作為模板體外合成正義鏈或反義鏈RNA。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA 聚合酶的底物模板,因此線性質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物均可用作體外合成RNA的模板。 正義或反義RNA鏈取決于模板DNA序列與T7啟動(dòng)子的位置,DNA位于T7啟動(dòng)子的下游,T7 RNA聚合酶會(huì)轉(zhuǎn)錄出正義RNA,反之則為反義RNA鏈。 提供兩種T7 RNA 聚合酶:野生型(A3601)和耐熱型(A3603/A3604)。野生型T7 RNA 聚合酶可在37℃對(duì)模板進(jìn)行高效體外轉(zhuǎn)錄,與野生型噬菌體 T7 RNA 聚合酶相比,T7耐熱RNA聚合酶可在更高的溫度下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。它可在37-52℃條件下進(jìn)行高效的體外轉(zhuǎn)錄,最佳溫度為37℃,50℃反應(yīng)條件下仍然保留50%以上的活性,而野生型在此溫度下無(wú)活性;诖四蜔岬捏w外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)特性具有以下優(yōu)勢(shì):(1)提升了GC含量較高RNA的轉(zhuǎn)錄效率;(2)提升了長(zhǎng)片段RNA的合成能力;(3)在使用帽類似物時(shí),提高了共轉(zhuǎn)錄的加帽效率;(4)減少了 dsRNA 副產(chǎn)物的形成,降低了合成 RNA 的免疫原性; (5)提升NASBA和CRISPR核酸擴(kuò)增檢測(cè)性能。該系列酶均來(lái)自重組 E.coli BL21菌株純化而得,無(wú)核酸酶污染。 T7高產(chǎn)RNA合成試劑盒是基于T7 RNA聚合酶而組建的試劑盒,產(chǎn)量超過(guò) MegaScript T7 Transcription kit,可在體外高效合成多種類型的 RNA,如mRNA、lncRNA、shRNA等。利用T7 RNA 聚合酶2.0識(shí)別T7 promoter(TAATACGACTCA CTATA G G)以倒數(shù)第二個(gè)G堿基為起點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄,該試劑盒可以將少量樣本進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄,單次反應(yīng)可獲得高達(dá)150 μg 的產(chǎn)物,轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度可達(dá)5000nt以上。利用該試劑盒得到的 RNA 適用于多種下游應(yīng)用,如RNA結(jié)構(gòu)和功能研究、核酸酶生物化學(xué)研究、RNase保護(hù)分析探針、印跡雜交、反義 RNA 及 RNAi 實(shí)驗(yàn)、微陣列分析、顯微注射、體外翻譯和 RNA 疫苗等。 | ||
應(yīng)用 | ||
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1X T7 Transcription Buffer | ||
40 mM Tris (pH 7.8), 10 mM NaCl, 6mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 。 | ||
酶儲(chǔ)存液 | ||
10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。 | ||
儲(chǔ)存 | ||
-20°C可保存2年,避免反復(fù)凍融。 | ||
熱失活 | ||
75°C,10min。 | ||
注意事項(xiàng) | ||
1. 轉(zhuǎn)錄DNA模板的種類:推薦使用含T7啟動(dòng)子的線性化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物作為模板。 2. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會(huì)顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在質(zhì)粒DNA抽提過(guò)程中殘留的RnaseA會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量。通過(guò)酚-氯仿抽提的質(zhì)粒DNA為最佳模板。 3. 該酶對(duì)高濃度NaCl或KCl不耐受,當(dāng)其濃度高于 150mM時(shí),其活性受到顯著抑制(~50%)。 4. 在20μl反應(yīng)體系中加入0.02U熱穩(wěn)定無(wú)機(jī)焦磷酸酶可顯著提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量(提高25~50%)。 | ||
實(shí)例 | ||
1.野生型和耐熱型T7 RNA聚合酶的耐熱性能比較 以20ng DNA作為模板,分別在反應(yīng)體系(20 μl)中加入100U的T7 RNA聚合酶和T7 耐熱RNA聚合酶2.0進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,結(jié)果可見T7 耐熱RNA聚合酶2.0在50°C仍具有較高活性,而野生型T7 RNA聚合酶在該溫度下沒有活性。 | ||
2.熱穩(wěn)定無(wú)機(jī)焦磷酸酶對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量的影響 在反應(yīng)體系(20 μl)中加入0.02U的熱穩(wěn)定無(wú)機(jī)焦磷酸酶(貨號(hào)C5007)可顯著提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)量。 | ||
3.以不同大小的線性化質(zhì)粒作為模板,應(yīng)用T7耐熱RNA聚合酶2.0進(jìn)行轉(zhuǎn)錄性能測(cè)試 由結(jié)果可見:T7耐熱RNA聚合酶2.0在50°C條件下仍具有理想的轉(zhuǎn)錄活性。 | ||
4.以不同大小的PCR產(chǎn)物作為模板,應(yīng)用T7耐熱RNA聚合酶2.0進(jìn)行轉(zhuǎn)錄性能測(cè)試 由結(jié)果可見:T7耐熱RNA聚合酶2.0可有效轉(zhuǎn)錄>5000nt的RNA分子。 | ||
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