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T7 耐熱RNA Polymerase 2.0(高濃度)

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T7 RNA 聚合酶對T7噬菌體啟動子具有高度的特異性,并可以其作為啟動子,DNA作為模板體外合成正義鏈或反義鏈RNA。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA 聚合酶的底物模板,因此線性質粒、PCR產物均可用作體外合成RNA的模板。 正義或反義RNA鏈取決于模板DNA序列與T7啟動子的位置,DNA位于T7啟動子的下游,T7 RNA聚合酶會轉錄出正義RNA,反之則為反義RNA鏈。
提供兩種T7 RNA 聚合酶:野生型(A3601)和耐熱型(A3603/A3604)。野生型T7 RNA 聚合酶可在37℃對模板進行高效體外轉錄,與野生型噬菌體 T7 RNA 聚合酶相比,T7耐熱RNA聚合酶可在更高的溫度下進行體外轉錄。它可在37-52℃條件下進行高效的體外轉錄,最佳溫度為37℃,50℃反應條件下仍然保留50%以上的活性,而野生型在此溫度下無活性。基于此耐熱的體外轉錄反應特性具有以下優(yōu)勢:(1)提升了GC含量較高RNA的轉錄效率;(2)提升了長片段RNA的合成能力;(3)在使用帽類似物時,提高了共轉錄的加帽效率;(4)減少了 dsRNA 副產物的形成,降低了合成 RNA 的免疫原性; (5)提升NASBA和CRISPR核酸擴增檢測性能。該系列酶均來自重組 E.coli BL21菌株純化而得,無核酸酶污染。
T7高產RNA合成試劑盒是基于T7 RNA聚合酶而組建的試劑盒,產量超過 MegaScript T7 Transcription kit,可在體外高效合成多種類型的 RNA,如mRNA、lncRNA、shRNA等。利用T7 RNA 聚合酶2.0識別T7 promoter(TAATACGACTCA CTATA G G)以倒數第二個G堿基為起點開始轉錄,該試劑盒可以將少量樣本進行高效轉錄,單次反應可獲得高達150 μg 的產物,轉錄長度可達5000nt以上。利用該試劑盒得到的 RNA 適用于多種下游應用,如RNA結構和功能研究、核酸酶生物化學研究、RNase保護分析探針、印跡雜交、反義 RNA 及 RNAi 實驗、微陣列分析、顯微注射、體外翻譯和 RNA 疫苗等。

應用

  • 制備放射標記的 RNA 探針
  • 合成用于體外翻譯的 RNA
  • 合成用于結構、加工和催化性能研究的 RNA
  • 合成 RNA 反義鏈,調控基因表達

1X T7 Transcription Buffer

40 mM Tris (pH 7.8), 10 mM NaCl, 6mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 。

酶儲存液

10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。

儲存

-20°C可保存2年,避免反復凍融。

熱失活

75°C,10min。

注意事項

1. 轉錄DNA模板的種類:推薦使用含T7啟動子的線性化質粒和PCR產物作為模板。
2. 轉錄模板的純度會顯著影響體外轉錄反應。在質粒DNA抽提過程中殘留的RnaseA會顯著影響轉錄RNA的質量。通過酚-氯仿抽提的質粒DNA為最佳模板。
3. 該酶對高濃度NaCl或KCl不耐受,當其濃度高于 150mM時,其活性受到顯著抑制(~50%)。
4. 在20μl反應體系中加入0.02U熱穩(wěn)定無機焦磷酸酶可顯著提高轉錄產量(提高25~50%)。

實例

1.野生型和耐熱型T7 RNA聚合酶的耐熱性能比較
以20ng DNA作為模板,分別在反應體系(20 μl)中加入100U的T7 RNA聚合酶和T7 耐熱RNA聚合酶2.0進行體外轉錄,結果可見T7 耐熱RNA聚合酶2.0在50°C仍具有較高活性,而野生型T7 RNA聚合酶在該溫度下沒有活性。
T7耐熱RNA聚合酶
2.熱穩(wěn)定無機焦磷酸酶對轉錄產量的影響
在反應體系(20 μl)中加入0.02U的熱穩(wěn)定無機焦磷酸酶(貨號C5007)可顯著提高轉錄產物的產量。
T7耐熱RNA聚合酶
3.以不同大小的線性化質粒作為模板,應用T7耐熱RNA聚合酶2.0進行轉錄性能測試
由結果可見:T7耐熱RNA聚合酶2.0在50°C條件下仍具有理想的轉錄活性。
T7耐熱RNA聚合酶
4.以不同大小的PCR產物作為模板,應用T7耐熱RNA聚合酶2.0進行轉錄性能測試
由結果可見:T7耐熱RNA聚合酶2.0可有效轉錄>5000nt的RNA分子。
T7耐熱RNA聚合酶
 
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