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南極熱敏UDG

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熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是來源于嗜冷海洋細菌經(jīng)大腸桿菌表達純化的的重組蛋白,又稱南極熱敏UDG。該熱敏UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧啶,產(chǎn)生的缺嘧啶位點,在高溫或高 pH 下,極易水解斷裂。該酶對RNA無活性,主要用于PCR擴增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱,經(jīng)95℃10min處理仍會殘留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性,導(dǎo)致含有dU堿基的PCR產(chǎn)物的降解。而來源于嗜冷海洋細菌的熱敏UDG在50℃ 5min即完全失活,在進行PCR擴增前,在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶(熱敏性),25℃10min即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染,由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶(熱敏性)在PCR循環(huán)的94℃變性一步便可被滅活,因此不會影響新的含dU的PCR產(chǎn)物。

組分

組分名稱 數(shù)量
Heatlabile Uracil DNA Glycosylase(1 U/μl) 100 μl/500 μl

應(yīng)用

  • 去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基
  • 去除 PCR 殘存污染

活性定義

在標準反應(yīng)體系下,37°C每分鐘催化 60 pmol 尿嘧啶從含尿嘧啶的雙鏈 DNA 上釋放所需要的酶量為一個活性單位。

反應(yīng)buffer

Heatlabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)與絕大多數(shù)的PCR 聚合酶反應(yīng)緩沖液都是兼容的,但在高離子濃度(>100mM)下活性會受到抑制。

酶保存液

20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。

儲存

-20℃可保存2年,避免反復(fù)凍融。

熱失活

50℃,10min。

實例

為評估熱敏UDG對殘留模板去除的能力,我們首先使用含dUTP的RAPA3G Probe qPCR MasterMix擴增三種基因產(chǎn)物(GAPDH,EHP,Covid-19 N Gene),然后以105拷貝的含U產(chǎn)物作為模板,分別加入0.1U/reaction、0.25U/reaction、0.5U/reaction和1U/reaction 的熱敏UDG(C5029)進行qPCR,程序如下:
25℃      2min,
95℃      5min
95℃      5s
60℃      30s     45cycles
25℃孵育2min使UDG發(fā)揮活性,降解含U產(chǎn)物,以降低其產(chǎn)生假陽性信號的機會;統(tǒng)計三組加熱敏UDG和不加UDG組反應(yīng)的Ct值(如下表),得到△Ct,△Ct值越大說明去除殘留產(chǎn)物的效率越高。本實驗說明:0.1U/反應(yīng)的該熱敏UDG即可很好的降解含U產(chǎn)物(如下圖),即具有良好的去除殘留模板的能力。
熱敏 UDG(C5029) GAPDH Ave.Ct EHP Ave.Ct Covid-19 N Gene Ave.Ct
0 19.5 19.6 21.3
0.1 U/reaction 34.8 36.8 37.9
0.25U/reaction 37.3 39.9 38.2
0.5 U/reaction 35 36.9 38.9
1 U/reaction 36.6 39.5 39.3
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