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Exonuclease III

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核酸外切酶 III來源于E.coli,具有3'-5'外切酶活性,它作用于雙鏈 DNA,從 3' OH 末端方向逐步切去單核苷酸;每次酶與底物結(jié)合催化,只有幾個(gè)核苷酸被除掉,從而在 DNA 分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進(jìn)缺失。該酶的最佳底物為平末端、5'突出末端雙鏈DNA分子,但也可作用于雙鏈DNA的缺刻處,從3'降解DNA分子,釋放5'單核苷酸。對(duì)于3'突出末端,尤其是多于4nt的幾乎完全不切割, 亦不能切割硫代磷酰脂鍵。核酸外切酶 III 的活性部分依賴螺旋結(jié)構(gòu),并根據(jù)序列的不同而有差異(C>A=T>G)。另外,核酸外切酶 III還具有脫嘌呤/嘧啶-核酸內(nèi)切酶活性、RnaseH活性和3' 磷酸酶活性。

組分

名稱 數(shù)量
Exonuclease III (100 U/μl) 50 μl
10X Exonuclease III Buffer 1 ml

應(yīng)用

  • 非定向巢式缺失
  • 定點(diǎn)突變
  • 鏈特異性探針的制備
  • 制備用于雙脫氧測序的單鏈底模板

單位定義

50 μl 反應(yīng)體系中,37℃ 條件下,30 分鐘 催化E.coli DNA 產(chǎn)生 1 nmol 酸可溶性產(chǎn)物所需要的 量定義為一個(gè)活性單位。

1X Exonuclease III Buffer

10 mM Bis-Tris(pH 7.0),10 mM MgCl2,1 mM DTT。

熱失活

70°C 20min。

儲(chǔ)存

置于-20°C,可保存3年。

實(shí)例

exonuclease III exonuclease III
Fig 1:分別用不同的內(nèi)切酶切質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5'突出末端、平末端和3'突出末端產(chǎn)物,然后用Exonuclease III(2.5U)分別酶切這三種產(chǎn)物(5 μg),將酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳。泳道1:5'突出末端產(chǎn)物;泳道2:平末端產(chǎn)物;泳道3:3'突出末端產(chǎn)物;M:DNA Marker 10000。 ? Fig 2:EcoR V酶切pUC57質(zhì)粒獲得酶切產(chǎn)物,然后分別用不同量的Exonuclease III酶切該產(chǎn)物獲得漸進(jìn)缺失產(chǎn)物。泳道1:對(duì)照(不加Exonuclease III); 泳道2:0.312U Exonuclease III; 泳道3:0.625U Exonuclease III; 泳道4:1.25U Exonuclease III; 泳道5:2.5UExonuclease III; M:DNA Marker 10000。
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