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NMY51感受態(tài)細胞

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產(chǎn)品簡介:

DUALmembrane 系統(tǒng)是 DUALsystems BioTech 公司開發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測技術,它利用分離的泛素系統(tǒng)(split-ubiquitin)直接檢測天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用,是目前市面上唯一檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用 NMY51 酵母菌株,可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗;此菌株Transformation marker 為: trp1, leu2-3,報告基因為:HIS3, ADE2 和 lacZ,第一步通過營養(yǎng)缺陷型報告基因(HIS3, ADE2)進行選擇性生長篩選,進一步通過 LacZ 報告基因進行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選,三個獨立的報告基因,受不同啟動子的調(diào)控,降低假陽性幾率。原理:泛素(ubiquitin)分子量很小,由 76aa 殘基組成;泛素作為降解信號分子,可以連接另外一種蛋白質(zhì)的 N 端,然后被泛素專一性蛋白酶(UBPs)識別,從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分:N 端(Nub),C 端(Cub)。首先,人為地將泛素 Nub 的 3 位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI 突變?yōu)?NubG)。這樣與 Cub 的親合力大大降低,避免了 Cub 和 Nub 自我結(jié)合或接近的可能性。其次,將 Cub 部分與人工合成的 LexA-VP16 轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個融合蛋白 Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG 不與 Cub 結(jié)合,UBPs 也不能識別分離的泛素,轉(zhuǎn)錄激活因子也不會被切下來。最后,將要檢測的蛋白質(zhì)分別與 NubG 和 Cub 融合,形成 bait 融合蛋(bait-cub-LexA -VP16)和 prey 融合蛋白(prey-NubG)。如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用,就會促使 NubG 和 Cub 的相互接近,被 UBPs 識別,導致 LexA-VP16 的解離,進入核內(nèi),從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。 此系統(tǒng)可使用四種 Bait 質(zhì)粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE,pBT3-C,篩選標志均為 LEU;三種 Prey 質(zhì)粒:pPR3-C ,pPR3-SUC,pPR3-STE,篩選標志均為 TRP。High5TM 系列 NMY51 感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作。

 

存儲及有效期:-80℃可保存三個月
 
經(jīng) PGADT7 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA 。
 
操作步驟(僅供參考):
1. 取 100 µl 冰上融化的 NMY51 感受態(tài)細胞,依次加入預冷的目的質(zhì)粒 2-5 µg,Carrier DNA (95-100 度 5 min,快速冰浴,重復一次) 10 µl,PEG/LiAc 500µl 并吸打幾次混勻,30 度水浴 30 min (15 min 時翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻)。
2. 將管放 42℃水浴 15 min (7.5 min 時翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻)。
3. 5000 rpm 離心 40 s 棄上清,ddH2O 400 µl 重懸,離心 30s 棄上清。
4. ddH2O 50 µl 重懸,涂板,29℃培養(yǎng) 48-96 h。
 
注意事項:
1. 感受態(tài)細胞最好在冰上融化。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應減少最終用于涂板的菌量。
3. 同時轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。
4. NMY51 酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為 27-30℃;高于 31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂 YPDA平板 29℃,48h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克。煌 SD 單缺平板 29℃,48-60h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆,涂 SD 雙缺平板 29℃,60-80h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆,涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃,80-90h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆。
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