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GV3101 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞

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GV3101 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞

GV3101 Chemically Competent Cell

保存條件  -80℃

產(chǎn)品規(guī)格:

 

GV3101

10x100μl

pCAMBIA2301  (control vector)

10ng/ul 10ul

 

      

C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline

 

      

 

GV3101 菌株為 C58 型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因 rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一 無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型 Ti 質(zhì)粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA) ,此質(zhì)粒含有 vir 基因(vir 基因是 T-DNA 插入植物基因 組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA  利轉(zhuǎn)移)。 pMP90 (pTiC58DT-DNA) Ti 質(zhì)粒含有篩選標簽:Strep gent ,賦予 GV3101 菌株鏈霉素和慶大霉素抗 性,適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作,GV3101 化轉(zhuǎn)感受態(tài)經(jīng)特殊工藝制作,經(jīng) pCAMBIA2301 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達 104cfu/μg。

 

      

 

1.     -80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化,處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中

2.      100μl 感受態(tài)加 1ug  (體積不大于 10ul) 質(zhì)粒 DNA,用手撥打管底混勻,依次于冰上靜置 5 分鐘、液氮 5 分鐘、 28℃水浴 5 分鐘、 冰浴 5 分鐘。

3.     加入 700μl 無抗生素的 LB YEB 液體培養(yǎng)基, 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時。

4.    6000rpm 離心一分鐘收菌,留取 100μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的 LB  YEB 平板上,倒 置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 (當平板只含有 50ug/ml kan 時,28℃培養(yǎng) 48h 即可;平板中同時加入 50ug/ml kan 20ug/ml rif 時,  28℃培養(yǎng) 60h ;如果使用的平板含有 50ug/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90h)。

 

   

1.     加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10 ;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大


一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2.     混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。

3.     轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?上鄳(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.     利福平濃度不應(yīng)高于 25ug/ul ,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司 態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有 50ug/ml kan ,若所用平板含有 20ug/ml rif 則轉(zhuǎn)化效率降低到 1/2

5.     培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、 篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質(zhì) 粒丟失,但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti 質(zhì)粒丟失的 率極低(可以忽略)。

注:

1.     農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方:

 

生素

作液

羧芐青霉素(carb)

雙蒸溶解, 0.22um 濾膜過濾除菌

50mg/ml

50ug/ml

酸卡那霉素(kan)

雙蒸溶解, 0.22um 濾膜過濾除菌

50mg/ml

50ug/ml

霉素(strep)

雙蒸溶解, 0.22um 濾膜過濾除菌

10mg/ml

50ug/ml

福平(rif)

DMSO 溶解, 0.22um 濾膜過濾除菌

10mg/ml

20ug/ml

大霉素(gent)

雙蒸溶解, 0.22um 濾膜過濾除菌

20mg/ml

40ug/ml

 

2.     常用農(nóng)桿菌抗性:  (R:抗;S:敏感。)

 

農(nóng)桿菌菌株

羧芐青霉(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL- 1

R

R

R

S

S

EHA105

S

R

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

R

R

R

S

 

3.     LB  YEB 配方:

 

component

LB(液體)/L

LB(固體)/L

component

YEB(液體)/L

YEB(固體)/L

Tryptone

10g

10g

Tryptone

5g

5g

Yeast extract

5g

5g

Yeast extract

1g

1g

NaCl

10g

10g

肉浸膏

5g

5g

NaOH

調(diào) PH 7.0

調(diào) PH 7.0

5g

5g

Agar

15g

MgSO4 *7H2O

0.49g

0.49g

 

 

 

NaOH

調(diào) PH 7.0

調(diào) PH 7.0

 

 

 

Agar

15g

 

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