ABTS 自由基清除能力檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：YC4770
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時雅吉工作人員。
| 試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
| 提取液 | 液體 60 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑一 | 液體 80 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑二 | 粉劑×1 瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑三 | 液體 20 μL×1 支 | 2-8℃保存 |
| 試劑四 | 液體 1.5 mL×1 支 | -20℃保存 |
| 試劑五 | 粉劑×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1 、 試劑二：臨用前加入 3 mL 蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑可分裝后保存，-20℃可保存四周，避免反 復凍融；
2 、 試劑三工作液的配制：液體置于試劑瓶內(nèi)EP 管中。臨用前根據(jù)樣本量按試劑三 (μL)：蒸餾水 (mL) = 1 μL:12 mL 的比例配成試劑三工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，盡量在 4h 之內(nèi)用完；
3 、 試劑四工作液的配制：可先將試劑四-20℃分裝保存。 臨用前根據(jù)樣本量按試劑四：試劑一 (V:V) = 1:9 的比例配成試劑四工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，現(xiàn)配現(xiàn)用，用不完的試劑放于-20℃可保存兩周。
4 、 試劑五：粉劑置于試劑瓶內(nèi)玻璃瓶中，含有 5 mg 維生素 C 。臨用前加入 2.8 mL 提取液，充分振蕩溶解； 配成 10 mmol/L 維生素 C 溶液，用于陽性對照。2-8 ℃可保存兩周。
5 、 ABTS 工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二：試劑三工作液 (V:V:V) =76:5:4 的比例配成 ABTS 工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫避光保存，務必在 30 分鐘內(nèi)使用。
產(chǎn)品說明：
ABTS 法可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定，是使用最廣泛的間接檢測方法。ABTS 經(jīng)氧化后生成穩(wěn) 定的藍綠色陽離子 ABTS 自由基，在 405 nm 或 734 nm 處有最大吸收峰。被測物質(zhì)加入 ABTS 自由基溶液后，所 含抗氧化成分能與 ABTS 自由基發(fā)生反應而使反應體系褪色，405 nm 的吸光度下降，在一定范圍內(nèi)其吸光度的變 化與自由基被清除的程度成正比。本試劑盒中，通過測定吸光度下降的程度來反映樣本清除 ABTS 自由基的能力。
ABTS H2O2、POD ABTS·+ (405 nm) Antioxidants ABTS
注意：實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋、臺式離心機、研缽/粉碎機、烘干箱、30~50 目篩、冰、蒸 餾水。
操作步驟：
一、樣本處理 (可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻)
1、植物組織樣本的制備：將新鮮樣本置于 60℃烘箱烘干至恒重，研缽研碎 (或粉碎機粉碎)，過 30~50 目篩； 稱取約 0.05 g 樣本，加入 1 mL 提取液后置于 40℃水浴鍋中浸提 30 min ；10000 rpm 室溫離心 10 min ，取上清， 置于冰上待測。
2 、紅酒、果汁等液體樣本：吸取 100 μL 樣本溶液加入 900 μL 提取液，旋渦振蕩混勻，室溫 10000 rpm 離心
10 min ，取上清，置冰上待測。
3 、提取物或者藥物：可用提取液配制成一定濃度，如 5 mg/mL。
注意：不同樣本清除 ABTS 自由基的能力可能相差很大，為保證實驗結(jié)果的準確性，樣本要根據(jù)預實驗結(jié)果 進行適當調(diào)整 (如清除率大于 90% ，建議將提取的樣本用提取液進行稀釋；清除率小于 5% ，建議加大烘干樣本 質(zhì)量或液體樣本體積進行提取)。
二、測定步驟
1 、分光光度計預熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長至 405 nm ，蒸餾水調(diào)零。
2 、陽性對照的準備：若需要線性關系，建議將 10 mmol/L 的維生素 C 溶液用提取液配制成 1 、0.8 、0.6 、0.4、
0.2、0. 1 mmol/L 的維生素 C 溶液待用，稀釋可參考下表；若需要清除率約為 90%的陽性對照，則建議將 10 mmol/L 維生素 C 溶液用提取液配制成大于 1.5 mmol/L 的維生素 C 溶液待用。
| 序號 | 稀釋前濃度 (mmol/L) | 維生素 C 溶液體積 (µL) | 提取液體積 (µL) | 稀釋后濃度 (mmol/L) |
| 1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
| 2 | 1 | 160 | 40 | 0 8 |
| 3 | 1 | 120 | 80 | 0.6 |
| 4 | 1 | 80 | 120 | 0.4 |
| 5 | 1 | 40 | 160 | 0.2 |
| 6 | 1 | 20 | 180 | 0.1 |
備注：實驗中每個標準管需 50µL 維生素 C 溶液。
3 、操作表：在 EP 管中分別加入下列試劑：
| 試劑名稱 (μL) | 空白管 | 測定管 | 對照管 | 陽性對照管 |
| 上清液 | - | 50 | 50 | - |
| 不同濃度的 VC 溶液 | - | - | - | 50 |
| 蒸餾水 | 50 | - | - | - |
| 試劑四工作液 | 100 | 100 | - | 100 |
| ABTS 工作液 | 850 | 850 | - | 850 |
| 試劑一 | - | - | 950 | - |
| 充分混勻，室溫避光靜置 6 min 。測定 405 nm 處的吸光度。分別記為 A 空白、A 測定、A 對照、A 陽性對 | ||||
| 照，陽性對照標準曲線和空白管只需測 1-2 次。 |
三、ABTS 自由基清除率的計算
1. 陽性對照的自由基清除率計算公式：
ABTS 自由基清除率 DVC% =[(A 空白-A 陽性對照)÷A 空白]×100%。
2. 樣本的自由基清除率計算公式：
ABTS 自由基清除率 D% =[A 空白-(A 測定-A 對照)]÷A 空白×100%。
注意事項：
1、不同樣本清除 ABTS 自由基的能力可能相差很大，如果要比較不同樣本的 ABTS 自由基清除能力，建議對 于同一批樣本加入等量的樣本，紅酒、組織勻漿、果汁等液體樣本加入同樣體積，提取物 (或者藥物) 配制成同 樣濃度。在比較時，將樣本根據(jù)預實驗結(jié)果進行適當調(diào)整，比較同樣濃度 (相同稀釋倍數(shù)) 的清除率大小。
2 、樣本建議當天提取當天檢測。
實驗實例：
1 、 取 0.05 g 辣椒加入 1 mL 提取液進行勻漿研磨，離心取上清后按照測定步驟操作，計算清除率得： D% = [A 空白-(A 測定-A 對照)]÷A 空白×100% =[1.330-(0.468-0.022)]÷ 1.330×100% = 66.466%。
