注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕�。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應(yīng)作準備。
測定原理：ACO催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD+ 還原生成NADH，導致340nm處光吸收上升。
需自備的儀器和用品：紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：1mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：液體5mL×1瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加3mL蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用
試劑七：粉劑×1支，4°保存；臨用前加36mL試劑四充分溶解；
工作液：臨用前在36mL試劑七中加入3mL蒸餾水、3mL試劑四、3mL試劑五、3mL試劑六充分混勻
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。
5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。
測定步驟：
1、 分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
（1）將工作液，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。
（3）在1mL石英比色皿中加入100μL樣本900μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值
A1和 3min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。
ACO活性計算：
用石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ACO活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=108×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ACO活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.722×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
