細胞內(nèi)pH（Intracellular pH，pHi）是酶活性和細胞功能的重要生理決定因素，所有蛋白質(zhì)都依賴于嚴格調(diào)節(jié)的pH值以維持其結(jié)構(gòu)和功能。質(zhì)子 - 去質(zhì)子化可以指示生物表面的電荷，并且是許多代謝反應(yīng)中的組成部分。此外，跨線粒體膜的質(zhì)子梯度用于產(chǎn)生細胞能量并支持其他線粒體過程。因此，細胞已經(jīng)開發(fā)出多種機制來保持pHi的窄范圍，以響應(yīng)pH值的細胞內(nèi)和細胞外波動。 細胞內(nèi)pH值檢測試劑盒采用P06細胞內(nèi)pH值熒光探針檢測胞內(nèi)pH值的變化。BBcellProbeTM P06是pH敏感的熒光染料，其在堿性條件下熒光強更高，反之酸性條件下變低，從而BBcellProbeTM P06可被用于監(jiān)測細胞內(nèi)pH變化，見圖一。 P06是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，BBcellProbeTM P06本身沒有熒光，穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成熒光物質(zhì)，從而被滯留在細胞內(nèi)。產(chǎn)生的熒光物質(zhì)最大激發(fā)波長為 488nm，最大發(fā)射波長為 640nm，其在不同的pH值條件下發(fā)射的熒光強度不同，從而可以反映細胞內(nèi)pH值得變化情況。 P06主要用于哺乳動物細胞的研究，也可用于其他動物組織、植物細胞、細菌和酵母等的細胞內(nèi)pH水平檢測。在有細胞內(nèi)pH變化的細胞毒性、細胞凋亡、細胞粘附、藥物抵抗、細胞趨化等過程中也可應(yīng)用。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488-530nm左右，發(fā)射波長為 640nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)pH值的變化。 本試劑盒內(nèi)P06探針母液500-5000倍稀釋后使用，一般1000-2000倍稀釋使用即可，按每個樣500 μl計算，50μl母液至少可以做100-200個樣品。 本試劑盒主要用于細胞內(nèi)pH值變化的定性檢測。如果需要測定細胞內(nèi)pH值數(shù)值。 可以提供各種細胞檢測試劑盒。包括細胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、細胞代謝、氧化應(yīng)激、細胞膜流動性、膜通透性轉(zhuǎn)換孔、細胞耗氧率、細胞內(nèi)pH、細胞粘附、細胞自噬等數(shù)百種檢測試劑盒產(chǎn)品。
2.探針A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
4P06探針容易受潮，受潮后穩(wěn)定性較差，注意干燥保存。
5.吸取 P06探針母液時要用干燥的新吸頭，不能使用含水的吸頭。
6.未使用完的P06探針母液請擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
7.試劑拆封后請盡快使用完！
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸頭
3.一次性手套
2.pH探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
3.P06探針容易受潮，受潮后穩(wěn)定性較差，注意干燥保存。
4.吸取P06探針母液時要用干燥的新吸頭，不能使用含水的吸頭。
5.未使用完的 P06探針母液請擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
6. P06探針工作液含水，配制后不可以長期保存，須現(xiàn)配現(xiàn)用。
7.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。
8.標記的條件因細胞種類而異，根據(jù)不同樣本的實際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實驗前，請先根據(jù)不同的實驗要求、細胞類型、細胞的膜通透性等進行優(yōu)化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。
9.熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
10.染色后立即進行分析。
11.可以在染色溶液中加入等體積的20% Pluronic F127溶液，Pluronic F127 可以幫助P06更快進入細胞，不建議在Pluronic F127中長期保存 P06溶液。
12.本試劑盒主要用于細胞內(nèi)pH值變化的定性檢測。如果需要測定細胞內(nèi)pH值數(shù)值
1. 染色工作液的配制：
根據(jù)樣品數(shù)，用探針稀釋液將P06探針進行10倍稀釋， 然后再用HBSS緩沖液稀釋 P06溶液20倍-200倍，配制成P06染色工作液。
2. 將 P06染色工作液加入已處理好的細胞，在37℃孵育30-60 分鐘。
3. 用PBS或HBSS洗滌細胞2-3次。用HBSS重懸細胞。
4. 然后用該細胞進行熒光細胞內(nèi)pH變化情況檢測。
激發(fā)波長 488-530nm，發(fā)射波長640nm。
