中文名稱小鼠白介素1β檢測試劑盒 

英文名稱Mouse IL-1β ELISA KIT 

反應(yīng)性Mouse 

樣品類型Serum, plasma, Cell culture supernatant 

靈敏度4 pg/ml 

檢測目標IL-1β 

應(yīng)用Sandwich ELISA 

背景介紹： IL-1 分為 IL-1a, IL-1β兩種,人和小鼠 IL-1 基因定位于 2 號染色體，均含 7 個外顯子。 IL-1 前體(ProIL-1)為 31kDa，通過蛋白水解酶裂解形成成熟的 IL-1 分子。IL-1 在不同種屬中有較高同源性。在氨基酸水平上，IL-1α和 IL-1β在不同種屬同源性分別為 60％～70％和 75％～78％；IL-1α和 IL-1β分子量約 17.5kDa, 等電點分別為 5 和 7，同源性為 28％ 。 17kDa 的成熟小鼠 IL-1β與棉鼠和大鼠的 IL-1β具有 90%的氨基酸序列同一性，與犬、馬、貓、人、豬和猴的 IL-1β具有 65%-78%的同一性。

IL-1β主要由血液中的單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生 , 星形細胞，少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞，腎上腺皮質(zhì)細胞，NK 細胞，內(nèi)皮細胞，角質(zhì)形成細胞，巨核細胞，血小板，神經(jīng)元，中性粒細胞，成骨細胞，許旺細胞，滋養(yǎng)層細胞，T 細胞和成纖維細胞也可產(chǎn)生 IL-1β 。IL-1 具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，并有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用。

檢測原理： ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠 IL-1β單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預(yù)稀釋的樣本，標準品和樣本中的小鼠 IL-1β會與酶標板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 IL-1β抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠 IL-1β發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 IL-1β，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠 IL-1β濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中小鼠 IL-1β的濃度。

注意事項：

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標準品，請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標準品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結(jié)果準確，每次檢測均需做標準曲線。安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

 

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清：將細胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本：室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本：將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。 ※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準備： 1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度：2000、1000、 500、 250、 125、62.5、31.25、 0 pg/ml進行稀釋。復(fù)溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。酶結(jié)合物工作液具體稀釋方法如下：

 

6. 洗滌方法：l 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/ 孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。l 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次

檢測步驟：

結(jié)果判斷： 1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。 2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值 3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中IL-1β含量可通過對應(yīng)OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。 4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應(yīng)做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征： 1. 數(shù)據(jù)及標準曲線

 

本圖僅供參考，應(yīng)以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠 IL-1β的樣本含量 2. 靈敏度：最低可檢測小鼠 IL-1β濃度達 15pg/ml，

2. 靈敏度：最低可檢測小鼠 IL-1β濃度達 15pg/ml，20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：不與小鼠 IL-2、3、4、6、7、10、IL-1a、IL-1Ra 等反應(yīng)

4. 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10% 5. 回收率：在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 IL-1β，計算回收率。

 

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 IL-1β，在標準曲線動 力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。