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黃曲霉毒素B1(AFB1 ELISA)試劑盒

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  黃曲霉毒素B1AFB1)酶聯(lián)免疫分析(ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。 

1 使用目的:

本試劑盒用于檢測豆粉飼料和谷物,玉米及食品,魚、蝦和肉類組織(如雞、牛肉和豬肉),雞蛋、蜂蜜、牛奶、羊奶,血清和尿樣,細胞黃曲霉毒素B1AFB1含量。

2 實驗原理

本試劑盒采用直接競爭ELISA方法,在微孔板包被有黃曲霉毒素B1AFB1偶聯(lián)抗原,加入黃曲霉毒素B1AFB1標準品或樣品,游離黃曲霉毒素B1AFB1與微孔條上預包被的黃曲霉毒素B1AFB1偶聯(lián)抗原互相競爭抗黃曲霉毒素B1AFB1抗體酶標記物,用TMB底物顯色,加入終止液后顏色由藍色變?yōu)辄S色,用酶標儀在450nm波長下進行檢測,吸光值與樣品中黃曲霉毒素B1AFB1含量成反比,通過標準曲線計算樣品黃曲霉毒素B1AFB1的含量。  

3 試劑盒組成

3.1 預包被的AFB1偶聯(lián)抗原的可拆酶標板:1塊(12×8條)。

3.2 AFB1標準品:6瓶(1ml/瓶),含量分別是: 0 ng/ml,0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1 ng/ml

3.3AFB1抗體酶結合物:1瓶(6ml)。

3.4顯色液A1瓶(6ml)。

3.5顯色液B1瓶(6ml)。

3.6終止液:1瓶(6ml),2M硫酸。

3.7樣本稀釋液:1瓶(10×,  6ml),用于樣品稀釋用。

3.8濃縮洗滌液:1瓶(2,20ml),用于洗板。

3.9說明書一份。


4 需要而未提供的材料

4.1 設備

4.1.1波長450nm酶標儀。

4.1.2粉碎機。

4.1.3量筒。

4.1.4振蕩器。

4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman No 1或相當?shù)臑V紙。

4.1.7微量移液器。

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇。

5 貯存

5.1 試劑盒貯存于2~8,切勿冷凍

5.2 未用完的微孔板應該密封干燥保存

6 注意事項

6.1 使用試劑盒前請仔細閱讀說明書。

6.2 不要使用過期試劑盒。

6.3 試劑盒使用前,將試劑恢復至室溫(25±2),建議至少回溫2小時。

6.4 標準品中含有黃曲霉毒素B1AFB1,使用時應特別注意,操作時應帶手套。

6.5 終止液中含有硫酸,使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6.6 不同標準品、樣品所用吸頭不能混用,否則會影響試驗結果。

6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用;不同標準品、樣品所用吸頭不得混用,否則會影響實驗結果。

6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,否則會影響實驗結果

6.9 混合試劑時應避免起泡。

7 工作液準備

7.1 AFB1標準品溶液:0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml

7.2 濃縮洗滌液:用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用

7.3 樣本稀釋液:用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用

7.3 顯色劑:已備用,避免光線直照

7.4 反應終止液:已備用

8 樣品處理程序(樣品在提取過程中,要嚴格按說明書操作,提取過程中應準確稀釋,否則會出現(xiàn)結果不準確,樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存)

8.110g粉碎的樣品,加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強力振蕩3分鐘

8.3Whatman No 1濾紙過濾

8.425µl處理后的樣品,加入25µl樣本稀釋液于反應孔中(樣本稀釋倍數(shù)為2

9 酶免分析步驟

9.1 實驗須知

9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復至室溫(25±2),時間約2小時。回溫至室溫(25±2)后再取出微孔條,多余的微孔條重新密封立即于2~8干燥保存

注:一定保證回溫充分,否則影響檢測的精確度和準確度。

9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8保存

9.1.3 請不要改變分析程序

9.1.4 請使用精確的微量移液器

9.1.5 操作一旦開始,請不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結果的可重復性極大程度的取決于操作程序,請嚴格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染,每個標準品和樣品均應使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內表面

9.2 分析步驟

9.2.1 預先進行編號,標記B0、標準品和樣品的位置,推薦進行雙孔檢測

9.2.2 取所需數(shù)量的微孔(微孔條可拆),將多余板條重新密封并立即放回2~8保存

9.2.3 樣品稀釋液(10×)、濃縮洗滌液(2)稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)

9.2.4 B0孔中加入50µl  0.0 ng/ ml標準品溶液

9.2.5 在各標準孔中加入50μl的標準品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗AFB1抗體酶結合物

9.2.8 輕輕晃動反應板幾秒鐘。

9.3 37溫浴30min (溫浴過程中不時輕拍反應板,可以減少雙孔誤差)

9.3.1 甩掉孔中液體,用洗液洗滌微孔板5次,最后一次應在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。

9.4 反應

9.4.1 洗滌程序完成后,立即用微量移液器在每個微孔中先加入50µl顯色液A,再加 50µl顯色液B;輕微晃動反應板使之徹底混勻

9.4.2 37溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50µl終止液,混勻

9.4.4 450nm下檢測吸光度,結果在5min內讀取。

10 結果計算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0 ng/ml標準溶液的平均吸光度值

10.1.2AFB1濃度的對數(shù)值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標準曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值,可從曲線上得到對應點的橫坐標,即為AFB1濃度的對數(shù)值,求得反對數(shù)即為測定液中AFB1濃度Cng/ml

10.1.3由于樣品經過了預先稀釋,因此根據(jù)標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定:首先選擇一個適當?shù)臉藴室号c樣品同運行,根據(jù)樣品與標準品顏色深淺比較,判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。

10.1.2儀器半定量測定:首先選擇一個適當?shù)臉藴室号c樣品同運行,根據(jù)樣品與標準品吸光度值的高低比較,判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。


11 特異性

物質 交叉反應

黃曲霉毒素B1 100%

黃曲霉毒素B2 80%

黃曲霉毒素G1 75%

黃曲霉毒素G2 30%

12 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0. 05ng/ml

B0吸光度最佳值應大于1.0

試劑盒吸光度板內誤差小于8%,板間誤差小于15%。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80%。

13

試劑盒提供的標準曲線范圍為0.1ng/ml~8.1ng/ml

 

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應該用另一種方法如HPLCGC/MS加以確證。


 

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