氯霉素檢測試劑盒
使用說明書
(酶聯(lián)免疫法)
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)組織、畜禽組織、肝臟、蛋類、蜂蜜、牛奶、飼料及水等樣本中的氯霉素藥物(Chloramphenicol,CAP),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液,樣本中的氯霉素藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素藥物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含氯霉素藥物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氯霉素藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度:0.025ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式:25℃,30min~30min~15min
2.3 檢測下限:
組織、肝臟、蜂蜜、牛奶……………0.0125ppb
水樣……………………………………0.05ppb
蛋類……………………………………0.1ppb
尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉……0.025ppb
2.4 交叉反應(yīng)率:
氯霉素 …………………………………100%
甲砜霉素、氟甲砜霉素………………<0.1%
2.5 樣本回收率:
組織、肝臟……………………………85%±20%
蜂蜜、腸衣、蛋類……………………85%±25%
牛奶、飼料……………………………75%±25%
尿液、血清……………………………70%±20%
水樣……………………………………90%±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml
0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):100ppb………1ml
酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………11ml
抗體工作液(藍(lán)蓋)………………5.5ml
底物液A(白蓋)……………………6ml
底物液B(黑蓋)……………………6ml
終止液(黃蓋)………………………6ml
20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml
2×復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)
4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑:乙酸乙酯、正己烷、醋酸鈉、醋酸
、亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5(NO)▪2H2O)、葡萄糖苷酸酶、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知:
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液:
配液1:0.36M亞硝基鐵氰化鈉溶液(牛奶、奶粉樣本)
10.7g亞硝基鐵氰化鈉加去離子水混勻溶解,定容至100ml。
配液2:1.04M硫酸鋅溶液(牛奶、奶粉樣本)
29.8g硫酸鋅加去離子水混勻溶解,定容至100ml。
配液3:0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液(尿液樣本)
2.4g醋酸鈉加去離子水混勻溶解,定容至500ml,再加1.2ml醋酸混勻。
配液4:復(fù)溶液(若檢測樣本為水樣,請勿稀釋,直接使用)
將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋(1份2×復(fù)溶液加1份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液5:工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟:
5.3.1 組織、魚、蝦、肝臟樣本處理方法
1)稱取均質(zhì)后的樣本3±0.05g于50ml離心管中,先加入3ml去離子水振蕩混勻,再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干;
3)用1ml正己烷溶解干燥的殘渣,再加入0.5ml復(fù)溶液,混合30秒,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層水相50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):0.5 檢測下限:0.0125ppb
5.3.2 血清、血漿樣本處理方法
1)取1ml血清或血漿至離心管中,加入2ml乙酸乙酯振蕩1分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,或靜置使水相與有機(jī)相分離;
2)取1ml上層液體在50-60℃下氮氣吹干;
3)用1ml正己烷溶解干燥的殘渣,再加入0.5ml復(fù)溶液,混合30秒,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層水相50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測下限:0.025ppb
5.3.3 尿液樣本處理方法
1)取2ml尿液至離心管中,加入0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液0.5ml混合,加40ul葡萄糖苷酸酶,混勻,37℃水解2小時以上(或過夜);
2)將上述溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯振蕩1分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,取4ml上層液體在50-60℃下氮氣吹干;
3)用1ml復(fù)溶液溶解干燥的殘渣,混勻;
4)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測下限:0.025ppb
5.3.4 蜂蜜樣本處理方法
1)取2±0.05g蜂蜜于離心管中,用4ml去離子水溶解,加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干;
3)用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘渣,混勻;
4)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):0.5 檢測下限:0.0125ppb
(檢測下限0.0125ppb,定量下限0.05ppb,因某些樣本有干擾建議以0.05ppb作為陽性判定值)
5.3.5 腸衣樣本處理方法
1)腸衣經(jīng)清洗后均質(zhì),稱取均質(zhì)后的樣本1±0.05g于50ml離心管中,加入10ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取上層液體5ml在50-60℃下氮氣吹干;
3)用1ml正己烷溶解干燥的殘渣,再加入0.5ml復(fù)溶液,混合30秒,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層水相50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測下限:0.025ppb
5.3.6 牛奶樣本處理方法
1)將牛奶樣本15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,去除上層脂肪,取5ml去脂肪奶樣于50ml離心管中,加250ul 亞硝基鐵氰化鈉溶液(配液1)振蕩混合30秒,加250ul 硫酸鋅溶液(配液2)振蕩混合30秒,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取上層液體2.2ml(相當(dāng)于2ml鮮奶)于另一離心管中,加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
3)取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干;
4)用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘渣,混勻;
5)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):0.5 檢測下限:0.0125ppb
(檢測下限0.0125ppb,定量下限0.025ppb,因某些樣本有干擾建議以0.075ppb作為陽性判定值)
5.3.7 奶粉樣本處理方法
1)取2±0.05g奶粉于50ml離心管中,用10ml去離子水溶解,加入1ml 亞硝基鐵氰化鈉溶液(配液1)和1ml 硫酸鋅溶液(配液2)振蕩混合,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取上層液體3.6ml(相當(dāng)于0.6g奶粉)于另一離心管中,加入6ml乙酸乙酯振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
3)取上層液體4ml在50-60℃下氮氣吹干;
4)用0.4ml復(fù)溶液溶解干燥的殘渣,混勻;
5)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測下限:0.025ppb
(檢測下限0.025ppb,定量下限0.075ppb,因某些樣本有干擾建議以0.075ppb作為陽性判定值)
5.3.8 蛋類樣本處理方法
1)取1±0.05g均質(zhì)的蛋類樣本于50ml離心管中,加8ml乙酸乙酯,振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;
2)取上層液體2ml于另一離心管中,在50-60℃下氮氣或空氣吹干;
3)用2ml正己烷溶解干燥的殘渣,再加入1ml復(fù)溶液,振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層水相50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):4 檢測下限:0.1ppb
5.3.9 飼料樣本處理方法
1)取2±0.05g均質(zhì)的飼料于50ml離心管中,用2ml去離子水溶解,再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取上層液體3ml在50-60℃下氮氣吹干;
3)用1ml正己烷溶解干燥的殘渣,再加入1ml復(fù)溶液,混合30秒,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層水相50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測下限:0.025ppb
5.3.10水樣本處理方法
1)取0.5ml澄清水樣于1.5ml離心管中,加入0.5ml 2×濃縮復(fù)溶液,振蕩1分鐘;
2)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):2 檢測下限:0.05ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
6.1 編 號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加抗體工作液50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干。(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
6.4 加酶反應(yīng):加酶標(biāo)記物100µl/孔,25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗 滌:同上
6.6 顯 色:加底物液A 50µl/孔,再加底物液B 50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時間)。
6.7 終 止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)= | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索。
8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位(A450nm< 0.5 )時,表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。
保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。