多西環(huán)素檢測(cè)試劑盒
使用說(shuō)明書(shū)
(酶聯(lián)免疫法)
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的多西環(huán)素藥物(Doxycycline,DOX),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的多西環(huán)素藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗多西環(huán)素藥物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含多西環(huán)素藥物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出樣本中多西環(huán)素藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度:0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式:37℃,30min~30min~15min
2.3 檢測(cè)下限:
組織、肝臟、雞蛋…………………2ppb
蜂蜜…………………………………2ppb
尿樣………………………………0.5ppb
牛奶………………………………2.5ppb
奶粉…………………………………4ppb
2.4 交叉反應(yīng)率:
多西環(huán)素……………………………100%
四環(huán)素………………………………143%
金霉素………………………………15%
土霉素………………………………15%
2.5 樣本回收率:
組織…………………………85±20%
肝臟、雞蛋…………………75±20%
蜂蜜…………………………85±20%
尿樣…………………………80±20%
牛奶、奶粉…………………75±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板………………………96孔
高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶:(1ml/瓶)1.0ppm(高標(biāo)準(zhǔn)液有揮發(fā)性,需注意密封)
標(biāo)準(zhǔn)品溶液0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb(均為空瓶子,現(xiàn)配現(xiàn)用)。
酶標(biāo)記物(紅蓋)……………………11ml
抗體工作液(藍(lán)蓋)…………………5.5ml
底物液A(白蓋)……………………6ml
底物液B(黑蓋)……………………6ml
終止液(黃蓋)………………………6ml
20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml
5×復(fù)溶液(黃蓋) …………………50ml
說(shuō)明書(shū)…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個(gè)
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)
4.2 微量移液器:?jiǎn)蔚?0µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑:濃鹽酸、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知:
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液:
配液1:復(fù)溶液
將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋?zhuān)?份5×復(fù)溶液加4份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
配液2:工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
配液3:樣本提取液
取4.3mL濃鹽酸加去離子水混勻,定容至50mL,再加入450ml無(wú)水甲醇。
5.3 樣本前處理步驟:
5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法
1)準(zhǔn)確稱(chēng)取1±0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中,加入2ml 樣本提取液(配液3),劇烈振蕩2min,使樣本徹底分散,充分與有機(jī)相接觸,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上,離心5min;
2)取出50ul上層液體(樣本脂肪多最上層會(huì)有白色漂浮物,不要取到),加入950ul復(fù)溶液混勻;
3)取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):40 檢測(cè)下限:2ppb
5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1)準(zhǔn)確稱(chēng)取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中,加入1ml樣本提取液(配液3),振蕩混勻2min,使蜂蜜充分溶解;
2)取出50ul混合液,加入950ul復(fù)溶液混勻;
3)取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):40 檢測(cè)下限:2ppb
5.3.3 尿樣本的處理方法
1)用復(fù)溶液將尿樣10倍稀釋?zhuān)ㄈ绻驑訙啙嵋欢ㄒ^(guò)濾或離心10min,4000r/min,直至得到清亮尿樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
2)取50µl稀釋的尿樣用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):10 檢測(cè)下限:0.5ppb
5.3.4 牛奶樣本處理方法
1)準(zhǔn)確吸取1ml牛奶于離心管中, 加2ml樣本提取液(配液3),振蕩2min,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上,離心5min;
2)取50ul上層液,加入950ul復(fù)溶液,混勻;
3)取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):40 檢測(cè)下限:2ppb
5.3.5 奶粉樣本處理方法
1)準(zhǔn)確稱(chēng)取1±0.05g奶粉于離心管中,加入4ml樣本提取液(配液3),振蕩2min,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上,離心5min;
2)取50ul上層液,加入950ul復(fù)溶液,混勻;
3)取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):80 檢測(cè)下限:4ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需配制標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液;低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定,需現(xiàn)配現(xiàn)用。
在0ppb的瓶中加復(fù)溶液3ml,0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb的瓶中分別加復(fù)溶液2ml,4.05ppb的瓶中加復(fù)溶液3ml。
標(biāo)準(zhǔn)液6:取1.0ppm高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液12ul加入裝有3ml 復(fù)溶液4.05ppb的瓶中,蓋緊,混勻,濃度即為4.05ppb。
標(biāo)準(zhǔn)液5:取1ml標(biāo)準(zhǔn)液6加入裝有2ml 復(fù)溶液1.35ppb的瓶中,蓋緊,混勻,濃度即為1.35ppb。
標(biāo)準(zhǔn)液4:取1ml標(biāo)準(zhǔn)液5加入裝有2ml 復(fù)溶液0.45ppb的瓶中,蓋緊,混勻,濃度即為0.45ppb。
標(biāo)準(zhǔn)液3:取1ml標(biāo)準(zhǔn)液4加入裝有2ml 復(fù)溶液0.15ppb的瓶中,蓋緊,混勻,濃度即為0.15ppb。
標(biāo)準(zhǔn)液2:取1ml標(biāo)準(zhǔn)液3加入裝有2ml 復(fù)溶液0.05ppb的瓶中,蓋緊,混勻,濃度即為0.05ppb。
標(biāo)準(zhǔn)液1:直接使用復(fù)溶液,濃度即為0ppb。
6.1 編 號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加抗體工作液50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌:小心揭開(kāi)蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干。(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
6.4 加酶反應(yīng):加酶標(biāo)記物100µl/孔,37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗 滌:同上
6.6 顯 色:加底物液A 50µl/孔,再加底物液B 50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,37℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過(guò)淺,可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間)。
6.7 終 止:加終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
6.8 測(cè)吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm)。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)= | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索。
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線(xiàn)照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。
保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。