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人各種動(dòng)物外周血樹突狀(DC)細(xì)胞分離液試劑盒

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&各種動(dòng)物外周血樹突狀(DC)細(xì)胞分離液試劑盒說明書及方法 【產(chǎn)品規(guī)格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:

 

 

名稱

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

A

分離液 1

 

200ml

B

分離液 2

 

200ml

C

清洗液 (贈(zèng)品)

 

200ml

D

說明書

 

1 

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

1.    適用儀器

最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)。

(離心機(jī)使用時(shí)調(diào)整為慢升慢降(具體參數(shù)請(qǐng)咨詢離心機(jī)廠家)建議升速(指開始啟動(dòng)→達(dá) 到設(shè)定離心力)的時(shí)間、降速(指設(shè)定離心時(shí)間完成→機(jī)器完全停止)時(shí)間均控制在 3 分鐘

左右。)

2.    抗凝劑的選擇

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采血時(shí),很多實(shí)驗(yàn)者選擇醫(yī)用真空采血管獲得抗凝血,醫(yī)用采血管中的抗凝 劑只考慮血漿質(zhì)量,但不利于高純度細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)(或必須使用枸櫞酸鈉的醫(yī)用真空抗凝采 血管)。

為此特別開發(fā)出專用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗凝劑及抗凝管專用于細(xì)胞分離,改變使用普 通采血管獲得抗凝血分離效果不佳,提取率及純度低下的不良結(jié)果。

 

序號(hào)

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

規(guī)格

1

 

TBDTM 細(xì)胞分離專用抗凝劑

TBDTM-0050

100ml

2

TBDTM-0200

200ml

3

TBDTM-0500

500ml

4

TBDTM 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次性使用負(fù)壓采血 管(隨試劑盒附贈(zèng) 5 支)

TBDTM-0001

5ml/

序號(hào)

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

規(guī)格

1

無菌硅化離心管/10ml(隨試劑盒附贈(zèng) 5 支)

TUB2015

100 /

3.    無菌硅化離心管


 

4.     目的細(xì)胞最佳分離時(shí)間

血液離體后 2 小時(shí)內(nèi)。如達(dá)不到 2 小時(shí)內(nèi)分血條件,請(qǐng)務(wù)必于 4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分血步驟, 超過 4 小時(shí)很難順利進(jìn)行分離。

 

血液離體時(shí)間

分離效果

2 小時(shí)內(nèi)

最佳

2-4 小時(shí)

可接受

4-6 小時(shí)

細(xì)胞活性下降,分離效果不佳

6 小時(shí)以上

分離效果極差,直至分離不出細(xì)胞

5.    分離液的使用環(huán)境

a.  分離液需常溫(15-25℃) 避光保存,嚴(yán)禁冷藏冷凍保存;

b.  使用時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范(超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)),并在 18-22℃環(huán)境溫 度下進(jìn)行操作,20℃條件下分離效果最佳。超出此溫度范圍,有可能使分離液密度發(fā)生 改變,造成分離效果不佳。

6.    參考值(目的細(xì)胞參考范圍)

本試劑盒可保證目的細(xì)胞的提取率大于 80% ,不是純度。如需獲得高純度目的細(xì)胞, 請(qǐng)配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量,減少成本。

 

【檢驗(yàn)方法】

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃(試劑需要復(fù)溫。夏季 20℃ , 冬季 23℃ 。)的條件下進(jìn)行。

 

實(shí)驗(yàn)方法:方法一如下(不需血漿留存?zhèn)溆?/span>):

1. 取一支 15ml 無菌離心管,先加入 5ml 分離液 1 ,后緩慢加入 2ml 分離液 2 ,形成梯度 界面,再緩慢吸取 2-3ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰; 取一支 50ml 無菌離心管,先加入 15ml 分離液 1 ,后緩慢加入 5ml 分離液 2 ,再緩慢吸  5- 15ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。(分離液試劑總 量不得少于 4ml ,新鮮抗凝血不得少于 2ml ?傄后w量不得超過 2/3)。

2.  500g  600g ,離心 30min(注:如改變血液樣本及分離液用量,需相應(yīng)調(diào)整離心力 及離心時(shí)間。)

3. 離心后,離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層環(huán)狀乳白色為(人及各 種動(dòng)物)樹突狀細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2)。第三層環(huán)狀乳白色為單個(gè)核 細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì) 胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

4. ①小心吸取血漿層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中備用(分離效果不理想,可進(jìn)行后續(xù)處理方案)。 ②小心吸取離心管中的(人及各種動(dòng)物)樹突狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 B 中。

③小心吸取離心管中的單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 C 中。

5. 向含有(人及各種動(dòng)物)樹突狀細(xì)胞層離心管 B 中,加入 5- 10ml 清洗液,混勻細(xì)胞。

6. 250g ,離心 10min 。棄去上清。

7. 用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。

8. 250g ,離心 10min ,棄去上清。

9. 重復(fù)清洗兩次,棄去上清,用 0.5ml 清洗液或根據(jù)下一步實(shí) 驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體,重懸所得細(xì)胞。

 

實(shí)驗(yàn)方法:方法二如下(需留取血漿備用):

1.  首先取抗凝血,250g ,離心 10min ,抽取血漿留存?zhèn)溆。補(bǔ)加胎牛血清(添加量與留存血 漿量等同)  制成細(xì)胞懸液,根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積,選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)。

2.  取一支 15ml 無菌離心管,先加入 5ml 分離液 1 ,后緩慢加入 2ml 分離液 2 ,形成梯度界 面,再緩慢吸取 2-3ml 細(xì)胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。或取一  50ml 無菌離心管,先加入 15ml 分離液 1,后緩慢加入 5ml 分離液 2,再緩慢吸取 5- 15ml 細(xì)胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。(分離液試劑總量不得少于 4ml ,細(xì)胞懸液不得少于 2ml ?傄后w量不得超過 2/3)。

 

3.   500g  600g ,離心 30min 。(注:如改變血液樣本及分離液用量,需相應(yīng)調(diào)整離心力 及離心時(shí)間。)

4.  離心后,離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層環(huán)狀乳白色為(人及 各種動(dòng)物)樹突狀細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2)。第三層環(huán)狀乳白色為單個(gè)核 細(xì)胞層(下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 層。第五層為粒細(xì)胞 層。第六層為紅細(xì)胞層。

5.  ①小心吸取稀釋液層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中備用(分離效果不理想,可進(jìn)行后續(xù)處理方案)。 ②小心吸取離心管中的(人及各種動(dòng)物)樹突狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 B 中。

③小心吸取離心管中的單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 C 中。

6.  向含有(人及各種動(dòng)物)樹突狀細(xì)胞層離心 B 中,加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào): 2010X1118),混勻細(xì)胞。

7.  250g ,離心 10min 。棄去上清。

8.  用吸管吸取 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。

9.  250g ,離心 10min ,棄去上清。

10.  重復(fù)清洗兩次,棄去上清,用 0.5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)或根據(jù)下一步實(shí) 驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體,重懸所得細(xì)胞。

分離圖

 

 

【分離過程中可能出現(xiàn)的情況及處理方案】

情況一:樹突狀細(xì)胞層和單個(gè)核細(xì)胞層混在一起不能分開

1.     吸取全部白色環(huán)狀細(xì)胞層,清洗后用備用的血漿 1-2ml 重懸細(xì)胞。

2.     使用分離液 2 重新提取樹突狀細(xì)胞。

3.      15ml 離心管,加入 4ml 分離液 2 ,將用血漿重懸的 1-2ml 細(xì)胞緩慢加于分離液之液 面上,400g ,離心 20min。

4.     離心后,離心管可分為 4 層,第一層血漿層,第二層樹突狀細(xì)胞層,第三層分離液層, 第四層單個(gè)核細(xì)胞層。

5.     可重復(fù)檢驗(yàn)方法中的目的細(xì)胞洗滌方法,獲得樹突狀細(xì)胞

 

【注意事項(xiàng)】

1.  全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃(夏季 20℃ , 冬季 22-25℃) 的條件下進(jìn)  行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),血液存放時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞分離 效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

2.  本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離心 管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì) 變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。

 

3.  分離液用量大于血液樣本時(shí),分離效果更佳。

4.  吸取過多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

5.  如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低,請(qǐng)聯(lián)系 技術(shù)支持以尋求幫助,具體聯(lián)系方式 詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟 封后置常溫保存。如 4℃保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。

【參考值(參考范圍)】

本實(shí)驗(yàn)樹突狀細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

 

 

紅細(xì)胞

白細(xì)胞

血小板

 

含量(個(gè)/L

 

4.0-5.5 ×1012

4.0- 10.0 ×109

 

1.0-3.0 ×1011

中性粒細(xì)胞

淋巴細(xì)胞

單核細(xì)胞

50%-70%

20%-40%

3%-8%

【可能存在的問題及解決方法】

1.    由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:

 

出現(xiàn)情況

出現(xiàn)原因

建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層

轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短

適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中

轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)

離心后白環(huán)層彌散

細(xì)胞密度過大

調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見

細(xì)胞密度過小

2.    離心力公

 

 

3.    本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離 心時(shí)間,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

4.    本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級(jí)原料,性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50- 100g 為基數(shù),直至達(dá)到最佳分離效果, 離心力最小不得小于 400g ,最大不得大于 1200g 。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

 

 

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