K599 Electroporation-Competent Cell是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌,它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物。K599發(fā)根農(nóng)桿菌(NCPPB2659)含有pRi2659農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒,具有廣泛的宿主范圍(葫蘆科,豆科,茄科等),同時具有鏈霉素抗性。
基因型:Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)
K599 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明
發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌,它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物。K599發(fā)根農(nóng)桿菌(NCPPB2659)含有pRi2659農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒,具有廣泛的宿主范圍(葫蘆科,豆科,茄科等),同時具有鏈霉素抗性。開發(fā)的K599電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作,pCAMBIA2301質(zhì)粒(卡那霉素抗性)檢測,轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA;經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒(size:40 kd)檢測轉(zhuǎn)化效率可達5×103 cfu/μg DNA。
常規(guī)操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,用試劑盒抽提,雙蒸水溶解;轉(zhuǎn)化效率較高,第次使用前做預實驗確定所加質(zhì)粒的量),用手打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì);旌衔锟焖僖频诫姄舯,蓋上杯蓋,空管保留待用。
3. 啟動電轉(zhuǎn)儀,設置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯從冰中拿出,吸水紙吸干外表面水份,快速放入電轉(zhuǎn)槽中,啟動電擊,電擊完成快速插入冰中,加入1 ml無抗生素的TY,并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的TY平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
● 農(nóng)桿菌相關抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧芐青霉素 (carb) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素 (kan) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
鏈霉素 (strep) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平 (rif) | DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
慶大霉素 (gent) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
氯霉素(cam) | 無水乙醇溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 34 mg/ml | 34 ug/ml |
常用農(nóng)桿菌抗性: (R:抗;S:敏感。)
農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 氯霉素(cam) | 硫酸卡那霉素(kan) |
Ar.A4 | S | S | S | S | R |
MSU440 | S | R | S | S | S |
Ar.Qual | S | R | S | R | S |
C58C1 | S | R | R | S | S |
ATCC15834 | S | S | S | S | S |
K599 | S | R | S | S | S |
Ar.1193 | R | R | R | S | S |
● TY配方(1L):
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
補水到1L體積,*溶解后,121度、20分鐘高溫滅菌
配制1M的氯化鈣水溶液,121度、20分鐘高溫滅菌
每1L 滅菌的TY液體營養(yǎng)液中加入10ml 無菌的1M氯化鈣水溶液即可。
若配制TY固體培養(yǎng)基,則加入15g 瓊脂粉。
注意事項
1. 加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
2. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞中不可混入氣泡,轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應減少終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質(zhì)粒用量或終用于涂板的菌量。
4. K599具有鏈霉素抗性,不可用于具有鏈霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。