LBA4404 Electroporation-Competent Cell為Ach5型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的章魚堿型Ti質(zhì)粒pAL4404,此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA
LBA4404 Electroporation-Competent Cell
產(chǎn)品規(guī)格
LBA4404 Elec: 50μl/支
pCAMBIA2301(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期): -80℃(12個月)
基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine
LBA4404 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明
LBA4404菌株為Ach5型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的章魚堿型Ti質(zhì)粒pAL4404,此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。 pAL4404型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽:strep,賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性,適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉基因操作。開發(fā)的LBA4404電轉感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉化:經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒 (size:11633 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA;經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒 (size:40 kd)檢測轉化效率可達103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,感受態(tài)轉化效率較高,一次使用前做預實驗確定所加質(zhì)粒的量),用手打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中,蓋上杯蓋,空管保留待用。
3. 啟動電轉儀,設置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
(當平板只含有50 μg/ml kan 時,28℃培養(yǎng)48 h即可;平板中同時加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,需28℃培養(yǎng)60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h)。
備注
1、農(nóng)桿菌相關抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧芐青霉素(carb) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素(kan) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
鏈霉素(strep) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平(rif) | DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
慶大霉素(gent) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用農(nóng)桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | S | R | S | S |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S |
3、LB及YEB配方:
component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
Agar | - | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
| | | NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 |
| | | Agar | - | 15 g |
注意事項
1. 加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉化效率下降一個數(shù)量級。
2. 混入質(zhì)粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質(zhì)?上鄳獪p少終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。