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GV3101(pSoup) Electroporation-Competent Cell

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 GV3101(pSoup) Elec:                                                50μl/支
pGs2(control vector,10ng/μl )                     10μl

基因型

C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pSoup-tetR)

GV3101(pSoup) Electroporation-Competent Cell

產品說明

GV3101(pSoup)菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽:gent,賦予GV3101菌株慶大霉素抗性;在GV3101菌株中轉入help質粒:pSoup即為GV3101(pSoup)菌株,可幫助pGreen,62SK,pGs2系列質粒在農桿菌中復制,同時賦予該菌株四環(huán)素(tet)抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。開發(fā)的GV3101(pSoup)電轉感受態(tài)特別適用于大質粒的轉化:經(jīng)pGs2(卡那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>10cfu/μg DNA;經(jīng)pGs2-ZH(卡那霉素抗性)質粒(size:40 kd)檢測轉化效率可達5×10cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入1-5 μg質粒DNA(質粒體積不大于6ul,用試劑盒抽提,雙蒸水溶解),用手管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態(tài)-質;旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋,空管保留待用。

3. 啟動電轉儀,設置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

(當平板只含有50 μg/ml kan 時,28℃培養(yǎng)48 h即可;平板中同時加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,需28℃培養(yǎng)60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h)。

備注

1、農桿菌相關抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧芐青霉素(carb

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

鏈霉素(strep

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

慶大霉素(gent

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用農桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

農桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S

 

3、LBYEB配方:

 

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10;質粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉化效率急劇下降;質粒增大一倍,轉化效率下降一個數(shù)量級。

2. 轉化高濃度的質?上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農桿菌生長,會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。

 

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失,但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作,所以一般培養(yǎng)農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti質粒丟失的概率極低 (可以忽略)。

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