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GV3101(pSoup) Chemically Competent Cell

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 GV3101(pSoup):                                                     100μl/支
pGs2(control vector,10ng/μl )                                    10μl

基因型

 

C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pSoup-tetR)

 

GV3101(pSoup) Chemically Competent Cell

產(chǎn)品說明

GV3101(pSoup)菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽:gent,賦予GV3101菌株慶大霉素抗性;在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒:pSoup即為GV3101(pSoup)菌株,可幫助pGreen,62SK,pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制,同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素(tet)抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的GV3101(pSoup)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10cfu/μg DNA。

 

操作方法

 

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化,處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2. 每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(轉(zhuǎn)化效率較高,次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量),用手管底混勻,依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基,于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

(當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時(shí),28℃培養(yǎng)48 h即可;平板中同時(shí)加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時(shí),需28℃培養(yǎng)60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h)。

 

注意事項(xiàng)

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?上鄳(yīng)減少終用于涂板的菌量,本公司生產(chǎn)的GV3101(pSoup)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞具有四環(huán)素抗性,但在轉(zhuǎn)入目標(biāo)質(zhì)粒涂板篩選陽(yáng)性克隆時(shí),只需加入目標(biāo)質(zhì)?剐缘目股,不加四環(huán)素。

3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過大時(shí),由于營(yíng)養(yǎng)不足,陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng),會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。

 

備注

 

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧芐青霉素(carb

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

鏈霉素(strep

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

慶大霉素(gent

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用農(nóng)桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

農(nóng)桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S

 

3、LBYEB配方:

 

component

LB(液體)/L

LB(固體)/L

component

YEB(液體)/L

YEB(固體)/L

Tryptone

10 g

10 g

Tryptone

5 g

5 g

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH 

調(diào)PH7.0

調(diào)PH7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g

 

 

 

NaOH 

調(diào)PH7.0

調(diào)PH7.0

 

 

 

Agar

15 g

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