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EHA101 Electroporation-Competent Cell

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 EHA101 Elec:                                                            50μl/支
pK7WGF2(control vector,10ng/μl )                            10μl

基因型

C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline 

EHA101 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品說(shuō)明

EHA101菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽:kan,賦予EHA101菌株卡那霉素抗性,適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。開(kāi)發(fā)的EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒 (壯觀霉素抗性,size:11876 bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10cfu/μg DNA;經(jīng)pK7WGF2-ZH質(zhì)粒(size:40 kd)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×10cfu/μg DNA。。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高,一次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量),用手打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì);旌衔锟焖僖频诫姄舯,蓋上杯蓋,空管保留待用。

3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

(當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí),28℃培養(yǎng)48小時(shí)即可;平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素,20 μg/ml rif 時(shí),需28℃培養(yǎng)60小時(shí);如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90小時(shí))。

 

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧芐青霉素(carb

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

鏈霉素(strep

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

慶大霉素(gent

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用農(nóng)桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

農(nóng)桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S

 

 

3LBYEB配方:

component

LB(液體)/L

LB(固體)/L

component

YEB(液體)/L

YEB(固體)/L

Tryptone

10 g

10 g

Tryptone

5 g

5 g

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH 

調(diào)PH7.0

調(diào)PH7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g

 

 

 

NaOH 

調(diào)PH7.0

調(diào)PH7.0

 

 

 

Agar

15 g

 

注意事項(xiàng)

 

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

 

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?上鄳(yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí),由于營(yíng)養(yǎng)不足,陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng),會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

 

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。

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