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Stbl4 Electroporation-Competent Cell50μl/支¥ 1080100 個(gè)
Stbl4 50μl/支
pUC19 (control vector,10pg/μl): 10μl
基因型
F′ proAB+ lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR)mcrA ∆(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1∆(lac-proAB)
Stbl4 Electroporation-Competent Cell
產(chǎn)品說明
Stbl4菌株來源于 Stbl2 E. coli strain,可用于慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建。Stbl4菌株適合克隆不穩(wěn)定插入片段 (正向重復(fù)序列,逆轉(zhuǎn)錄病毒序列等);mcrA突變和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使該菌株更適于克隆甲基化的基因組序列。recA 1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。lacIqZΔM15標(biāo)記使得Stbl4菌株可用于藍(lán)、白斑篩選,此菌株具有四環(huán)素抗性。生產(chǎn)的Stbl4電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)0.5×1010 cfu/μg DNA,特別適合于慢病毒質(zhì)粒文庫或逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒文庫的構(gòu)建。
操作方法
1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電擊杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的Stbl4電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質(zhì);蜻B接產(chǎn)物)并用手打EP管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。
A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19;
B. 對于連接產(chǎn)物,大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與Stbl4電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化,無需 進(jìn)行DNA純化,但DNA濃度不能過高,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。
C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸,然后與Stbl4電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。
4. 啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。
5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。30℃,225 rpm復(fù)蘇90分鐘。當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時(shí),30℃培養(yǎng)可降低錯(cuò)誤重組的概率,若轉(zhuǎn)化control pUC19計(jì)算轉(zhuǎn)化效率,則需37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘
6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的LB平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)17-20小時(shí)或30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)20-24小時(shí)。若轉(zhuǎn)化control pUC19計(jì)算轉(zhuǎn)化效率,則需37℃培養(yǎng)過夜。
7.若要獲得大量,高純度質(zhì)粒,建議在TB培養(yǎng)基中30度搖菌培養(yǎng)(以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PUC19為例:500ml三角瓶中加入100ml TB營養(yǎng)液,經(jīng)30度250rpm搖菌,可提取約100-200ug PUC19質(zhì)粒)
試驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀說明書,本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)使用。
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文獻(xiàn)名稱