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ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell

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                     ClearColi K12 Electro  Cell                                       50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                               10μl

恢復(fù)培養(yǎng)基                                                               50ml/瓶

基因型

FλendArecAfrr181 msbA52 gutQ kdsD lpxL lpxM pagP lpxP eptA

ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

ClearColi K12電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化,不能用于熱激轉(zhuǎn)化。ClearColi K12菌株來(lái)源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突變,導(dǎo)致ClearColi K12細(xì)胞壁外層的脂多糖(LPS)被修飾:LPS的低聚糖鏈被刪除,同時(shí)LPS的兩個(gè);溡脖粍h除,進(jìn)而破壞了ClearColi K12大腸桿菌的內(nèi)毒素信號(hào)通路,使得從該細(xì)胞中提取的蛋白或質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素含量極低,提取的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于后續(xù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。ClearColi K12同時(shí)缺失核酸內(nèi)切酶 (endA)和重組酶 (recA),提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。開(kāi)發(fā)的ClearColi K12電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×10cfu/μg DNA。

 

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的ClearColi K12電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA ,并用手打EP管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。

    A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19;

    B. 對(duì)于未知來(lái)源或組分不明的質(zhì)粒DNA,請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM              EDTA)重懸,DNA濃度不超過(guò)100 ng/μl,體積不超過(guò)5 μl/50 μl感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入1ml不含抗生素的無(wú)菌恢復(fù)培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加恢復(fù)培養(yǎng)基(室溫)至10 ml。37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

 

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的LB(務(wù)必使用高鹽培養(yǎng)基平板,不可用2YT,SOB,SOC等低鹽培養(yǎng)基)平板上(因菌量較大,若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時(shí)(培養(yǎng)24小時(shí)后可看到很小的克。

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