衰老細(xì)胞近紅外熒光探針(Senescence-Tracker™ Near-infrared, Senescence-Tracker™ NIR)，是一種新型的可用于體內(nèi)或體外高亮度、高穩(wěn)定性、高特異性、高生物安全性地檢測衰老細(xì)胞(Senescent cells, SnCs)的近紅外熒光探針。Senescence-Tracker™衰老細(xì)胞近紅外熒光探針能夠被衰老細(xì)胞特異性表達(dá)的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)特異識別并快速酶解，產(chǎn)生強(qiáng)烈的近紅外熒光信號。

絕大多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅具備有限的分裂能力，在停止分裂后就會逐漸進(jìn)入衰老(Senescence)狀態(tài)。此時細(xì)胞仍然是存活的，但細(xì)胞的基因和蛋白的表達(dá)譜發(fā)生了巨大改變。衰老細(xì)胞不能再發(fā)生有絲分裂，并且衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期分布也比較特殊，不同于某些損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞休眠(Dormancy)，也不同于細(xì)胞生長接觸抑制產(chǎn)生的細(xì)胞靜默(Quiescence)。細(xì)胞衰老被認(rèn)為是生物體抑制腫瘤的一種方式，但累積的衰老細(xì)胞同時也是生物體老化(Aging)的直接原因[2,3]。追蹤衰老細(xì)胞通常依賴于檢測衰老細(xì)胞的標(biāo)記物和表型特征，如細(xì)胞周期抑制蛋白p16和p21、衰老相關(guān)分泌表型(Senescent associated secretory phenotype, SASP)和衰老相關(guān)的β-gal (Senescence-associated β-gal, SA-β-gal) [4-6]。其中，SA-β-gal是最為廣泛接受和使用的細(xì)胞衰老生物標(biāo)志物。

Senescence-Tracker™衰老細(xì)胞近紅外熒光探針(Senescence-Tracker™ NIR)，又稱XZ1208，CAS號為3026598-16-0，分子式為C34H29N3O9，分子量為623.62，主要由3部分結(jié)構(gòu)組成：DCM (Dicyanomethylene-4H-pyran)-衍生的NIR熒光團(tuán)、β-Gal殘基和自裂解連接子(Self-immolative linker)。Senescence-Tracker™ NIR進(jìn)入衰老細(xì)胞后，糖苷鍵被細(xì)胞內(nèi)β-gal快速切割斷裂，隨后Senescence-Tracker™ NIR 的自裂解部分轉(zhuǎn)化為亞甲基苯醌(Quinone methides, QMs)，并最終激活NIR熒光團(tuán)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號，最大激發(fā)波長為490 nm，最大發(fā)射波長為760nm，可根據(jù)儀器的差異適當(dāng)優(yōu)化波長(可參照圖1優(yōu)化)。

本探針特異性強(qiáng)、靈敏度高。本探針僅染色衰老細(xì)胞，不會染色衰老前的細(xì)胞(Presenescent cells)、靜止期細(xì)胞(Quiescent cells)和大部分永生細(xì)胞(Immortal cells)；本探針在非衰老細(xì)胞和年輕小鼠中幾乎檢測不到熒光，但在衰老細(xì)胞和老年小鼠中可以檢測到顯著的熒光信號

本探針可應(yīng)用于活體成像，組織穿透能力強(qiáng)，具有更低的本底熒光。常規(guī)的β-Gal熒光成像探針激發(fā)和發(fā)射的波長主要位于可見光范圍，生物組織的吸收、散射以及自發(fā)熒光干擾導(dǎo)致背景信號高、組織穿透力差，限制了這些探針體內(nèi)成像的應(yīng)用。而本探針的發(fā)射波長位于近紅外(Near-infrared, NIR)窗口，具有很好的組織穿透力、較低的背景熒光和生物損傷。

本探針穩(wěn)定性好、追蹤間長、工作濃度低。經(jīng)測試，在多種方式誘導(dǎo)衰老的人胚胎肺成纖維細(xì)胞(Human embryonic lung fibroblasts, HELF)和衰老的人真皮成纖維細(xì)胞(Human dermal fibroblasts, HDF)中，本探針染色細(xì)胞后約2小時，就可以迅速被切割并產(chǎn)生明顯的熒光，熒光信號約24小時后達(dá)到峰值，48小時仍能基本保持穩(wěn)定；10μM的本探針處理HELF和HDF細(xì)胞48小時后換液，6天后細(xì)胞內(nèi)仍可檢測到熒光信號；低至0.5μM的本探針即可有效標(biāo)記衰老細(xì)胞；在小鼠模型中，尾靜脈注射低至5μM的本探針100μl，即可實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)實(shí)時檢測衰老程度，探針在1-2小時內(nèi)能被完全激活，并顯示出非常強(qiáng)的熒光信號，標(biāo)記效應(yīng)可持續(xù)至少6天[1]。

 本探針操作簡單，使用方便。常規(guī)的β-gal檢測法方法是基于β-gal催化X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)生成深藍(lán)色產(chǎn)物，如的細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、溶酶體β-半乳糖苷酶染色試劑盒。細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒方法注意事項(xiàng)繁多、實(shí)驗(yàn)器具要求高、操作相對復(fù)雜，并無法進(jìn)行活細(xì)胞或活體檢測。其它一些針對β-gal檢測方法雖然簡化了操作，使用更為便捷，但仍需要事先固定或者裂解細(xì)胞。而本探針可通過被動運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜，使用時，細(xì)胞水平只需進(jìn)行簡單共孵育培養(yǎng)，小鼠模型只需進(jìn)行尾靜脈注射即可，操作非常簡單，無需對細(xì)胞進(jìn)行固定或裂解，可實(shí)時檢測活細(xì)胞的衰老或活體小鼠中的衰老細(xì)胞。

Senescence-Tracker™ NIR對衰老細(xì)胞和小鼠的染色、成像效果參考圖1。

圖1.衰老細(xì)胞近紅外熒光探針對體外和體內(nèi)衰老細(xì)胞的染色效果圖。正常(Untreated)和經(jīng)X光照射(X-ray treated)誘導(dǎo)衰老的HELF細(xì)胞(人胚胎肺成纖維細(xì)胞)的檢測效果見圖A (激發(fā)波長595nm，檢測波長650-701nm)；3個月齡年輕小鼠及20個月齡衰老小鼠的成像效果見圖B (激發(fā)波長436-500nm，檢測波長570-700nm)�？筛鶕�(jù)儀器的差異適當(dāng)優(yōu)化波長。實(shí)際檢測效果會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本探針提供10mM溶液裝和粉末裝。10mM溶液裝配制在DMSO中，每0.1ml可以配制約100ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)；每1mg粉末可以配制約160ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)。

本探針已經(jīng)在衰老細(xì)胞(肺和皮膚來源的成纖維細(xì)胞)、自然衰老小鼠、輻照小鼠和皮膚損傷等模型中進(jìn)行過驗(yàn)證。在應(yīng)用于其它衰老細(xì)胞相關(guān)的模型時，需要進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化以驗(yàn)證探針效果。

須使用可以檢測近紅外熒光探針的激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡等熒光檢測設(shè)備用于衰老細(xì)胞的檢測；須使用可以檢測近紅外熒光探針的活體成像設(shè)備進(jìn)行小鼠等活體的衰老細(xì)胞檢測。

初次使用時可適當(dāng)分裝，避免反復(fù)凍融。

對于微量的液體，每次使用前先離心數(shù)秒鐘，使液體充分沉降到管底。

對于細(xì)胞染色，建議染色完成后立即進(jìn)行觀測；如果條件限制，請避光4℃保存，并在24小時內(nèi)進(jìn)行檢測，放置時間過久可能會導(dǎo)致熒光部分猝滅。

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。