注 意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當(dāng)于CYP2E1亞型,CYP2E1不僅參與了藥物的代謝,而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。
測定原理:
AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚,進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?/font>-吲哚復(fù)合物,在630nm處有特征吸收峰;通過測定630nm吸光度增加速率,來計(jì)算AH活性。
自備儀器及用品:
可見分光光度計(jì)、普通離心機(jī)、超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、雙蒸水和冰。
試劑組成和配制:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入50 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入26 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入13 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑五:液體×1瓶,4℃保存。
試劑六:粉劑×1瓶(腐蝕性試劑),4℃避光保存。臨用前加入26 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑七:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入26 mL蒸餾水充分溶解。
標(biāo)準(zhǔn)液:液體×1瓶,10μmol/L,4℃避光保存。
粗酶液提。
1、除去細(xì)胞核,線粒體等大分子物質(zhì):稱約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃,離心30min,取上清液,轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2、粗制微粒體: 100 000g 4℃,離心60min,棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì):向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。
4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。
測定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到630 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 試劑五置于冰浴預(yù)冷30min。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管:取1.5 mL EP管,加入500μL 標(biāo)準(zhǔn)液,500μL試劑六,500μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 對(duì)照管:取1支1.5 mL EP管,加入250μL粗酶液,500μL試劑三,250μL蒸餾水,混勻后37℃水浴中保溫30min;再加入500μL試劑五,混勻后冰浴5min,11000rpm,4℃,離心10min;取500μL上清液,
加入1支新的1.5 mL EP管;再加入500μL試劑六,500μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測定光吸收,記為A對(duì)照管。
6. 測定管:取1支1.5 mL EP管,加入250μL粗酶液,500μL試劑三,250μL試劑四,混勻后37℃水浴中保溫30min;再加入500μL試劑五,混勻后冰浴5min,11000rpm,4℃,離心10min;取500μL上清液,加入1支新的1.5 mL EP管;再加入500μL試劑六,500μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測定光吸收,記為A測定管。
AH活性計(jì)算公式:
(1) 按照蛋白濃度計(jì)算:
活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V樣)÷T
= 2×(A測定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr
(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
活性單位定義:37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。
AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 2×(A測定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品:10μmol/L;V標(biāo)準(zhǔn)品:500μL=0.0005L;稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=1500μL÷500μL=3;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;V樣:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積,250μL=0.25 mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,30min。