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氨基酸(AA)含量測(cè)試盒可見(jiàn)分光光度法

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     意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官,故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝、腎的生理狀態(tài)。另外,氨基酸還能反應(yīng)灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對(duì)研究植物在不同條件下及不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對(duì)氮素的吸收、運(yùn)輸、同化及營(yíng)養(yǎng)狀況等有重要意義。

 

測(cè)定原理:

氨基酸的α-氨基可與水合茚三酮反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物,在570 nm有特征吸收峰;通過(guò)測(cè)定570 nm吸光度,來(lái)計(jì)算氨基酸含量。

 

自備儀器及用品:

臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、無(wú)水乙醇、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4保存。

試劑二:液體×1瓶,4保存。

試劑三:粉劑×1瓶(棕色),4避光保存。臨用前加入2 mL無(wú)水乙醇,蓋緊后充分混勻,再加入28mL蒸餾水混勻,避光保存。

試劑四:粉劑×1瓶,4避光保存。臨用前加5 mL蒸餾水,充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1,臨用前加10 mL蒸餾水,充分溶解。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液,4℃避光保存。

 

樣品中AA提取:

1. 按照組織質(zhì)量(g試劑一(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行室溫勻漿然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中,蓋緊后(防止水分散失)置于沸水浴提取15 min;自來(lái)水冷卻后,8000g,4離心10min,上清液置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g,4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3. 血清等液體:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定操作

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到570 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取EP管,加入50μL蒸餾水,500μL試劑二,500μL試劑三和50μL試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,于570nm測(cè)定吸光值,記為A空白管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測(cè)完。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取EP管,加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品,500μL試劑二,500μL試劑三和50μL試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋

 

(防止水分散失),置于沸水浴中保溫15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,于570nm測(cè)定吸光值,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測(cè)完。

4. 測(cè)定管:取EP管,加入50μL上清液,500μL試劑二,500μL試劑三和50μL試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,于570nm測(cè)定吸光值,記為A測(cè)定管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測(cè)完。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次

 

氨基酸含量計(jì)算公式

1)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

氨基酸含量(μmol /g鮮重=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷V樣)÷W

=1×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷W

2)按照樣本蛋白濃度計(jì)算

氨基酸含量(μmol /mg prot=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷V×Cpr

=1×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷Cpr

3)按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)] ×V樣總÷V×細(xì)胞數(shù)量

=1×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

4)按照液體體積計(jì)算

氨基酸含量(μmol /mL=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷V

=1×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μ mol/mL;V標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.05 mLW:樣品質(zhì)量,gV樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.05 mL;V樣總:樣品提取液總體積,1mL,Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL。

 

注意事項(xiàng):

1. 試劑盒中試劑三試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制,且避光保存,配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢

2. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),如果測(cè)定的吸光值過(guò)高(高于2.5),用蒸餾水稀釋后再測(cè)定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在570nm處無(wú)吸收峰,因此,570nm處測(cè)定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4.最低檢出限為100μmol/L

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