注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
半胱氨酰亞砜裂解酶(CSL)廣泛存在于百合科蔥屬(如大蒜和洋蔥),十字花科蕓薹屬
(如卷心菜,菜花,西蘭花),以及豆科中的合金歡屬中,并通常被稱為蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶的作用下轉(zhuǎn)化成香菇精,以及產(chǎn)生丙酮酸、乙醛、甲醛和NH3。CSL是內(nèi)源性甲醛生成的關(guān)鍵酶之一,測(cè)定CSL活性對(duì)于研究食品安全具有重要意義。
測(cè)定原理
CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亞砜反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸,與2,4-二硝基苯肼反應(yīng),在堿性條件下顯棕紅色,在510nm下有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽、離心機(jī)、分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋、蒸餾水。
試劑組成和配制
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑×1瓶,4℃避光保存,臨用前加入2mL水溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存,臨用前加入10mL水溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存;
試劑三:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑五:液體30mL×1瓶,4℃保存。
樣本處理
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,4℃浸提40min。12000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定操作
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
樣品(μL) | 100 | 100 |
試劑一(μL) |
| 50 |
蒸餾水(μL) | 50 |
|
試劑二(μL) | 50 | 50 |
充分混勻,37℃反應(yīng)20min | ||
試劑三(μL) | 200 | 200 |
試劑四(μL) | 100 | 100 |
充分混勻,室溫反應(yīng)5min | ||
試劑五(μL) | 500 | 500 |
充分混勻,靜置5min,于1mL玻璃比色皿測(cè)定510nm處吸光值,記為A對(duì)照和A測(cè)定,△A=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 |
計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.4626x + 0.0027,R2 = 0.9993;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度:μmol/mL;y為吸光度△A
1. 按蛋白含量計(jì)算
C-S lyase活性(μmol/min/mg prot)=(△A -0.0027)÷ 1.4626×V樣÷(V樣×Cpr )÷T
=0.034×(△A-0.0027)÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
C-S lyase活性(μmol/min/g 鮮重)=(△A -0.0027)÷ 1.4626×V樣÷(V樣÷V樣總×W )÷T
=0.034×(△A-0.0027)÷ W
V樣,加入樣本上清體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T,反應(yīng)時(shí)間,20min。
注意事項(xiàng)
1. 若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò)2,請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。香菇類樣本活性較大,可能需要稀釋80-100倍。