正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS, Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶,對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。
測(cè)定原理:
吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成P5C過(guò)程中分解ATP生成ADP和無(wú)機(jī)磷,通過(guò)鉬酸銨比色法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷的量可確定P5CS活性。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體60 mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體6 mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體6 mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存,用時(shí)加入25 mL蒸餾水,溶解后4℃保存一周;
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存,用時(shí)加入25 mL蒸餾水,溶解后4℃保存一周;
試劑六:液體25mL×1瓶,室溫保存;
試劑七:10mmol/L標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液10mL×1瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑七 20倍稀釋,即取 0.1mL試劑七加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制:按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
樣品酶液的制備:
1、組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
操作步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm。
2、酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑二(μL) |
| 100 |
樣本(μL) |
| 100 |
混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min
試劑三(μL) | 100 | 100 |
試劑二(μL) | 100 |
|
樣本(μL) | 100 |
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混勻,8000g,25℃離心10min,取上清液
3、定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL) |
| 100 |
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上清液(μL) |
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| 100 | 100 |
蒸餾水(μL) | 100 |
|
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定磷試劑(μL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻,室溫放置30min,在 660nm處,記錄各管吸光值。
注意:
1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,本試劑盒50管保證測(cè) 24份P5CS活性。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。
3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
計(jì)算
1、血清(漿)P5CS活力的計(jì)算:
單位定義:每小時(shí)每毫升血清(漿)中P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
P5CS活力(μmol/h/mL)=C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷V樣÷T=9 ×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
2、組織中P5CS活力的計(jì)算:
(1)按蛋白濃度計(jì)算:
單位定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中P5CS消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
P5CS活力(μmol/h /mg prot)=C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷(Cpr×V樣)÷T =9 ×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位定義:每小時(shí)每克組織中P5CS消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
P5CS活力(μmol/h /g 鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=9 ×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.3mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL ;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。