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谷氨酸合成酶(GOGAT)測試盒紫外分光光度法

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 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

Gu廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,不僅是組成蛋白質的20種氨基酸之一,而且通過轉氨基作用參與多種氨基酸合成,是生物體內主要氨基來源之一。此外,Glu還是味精的主要有效成分,常用做食品添加劑以及香料生產(chǎn)。

 

 

測定原理:

利用專用提取液提取,然后用顯色劑進行顯色,顯色后在570nm下進行測定。

 

 

自備的儀器和用品:

可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

 

 

試劑的組成和配制:

 

試劑一:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑粉劑×1瓶, 4保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻溶解,用不完的試劑仍 4保存。

 

 

谷氨酸提取:

1、細菌或培養(yǎng)細胞樣品:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議1000萬細菌或細胞加入2mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 常溫離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織樣品按照組織質量(g:試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.2g組織,加入2mL試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)或細胞培養(yǎng)液樣品:按照血清(漿)或細胞培養(yǎng)液體積(mL:試劑一體積(mL)15~10的比例(建議0.2mL血清(漿)或者細胞培養(yǎng)液加入2mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟

1、 分光光度計預熱30min以上,調節(jié)波長至570nm,蒸餾水調零。

2、 在有蓋EP管中加入下列試劑

試劑名稱(μL

測定管

對照管

樣本

1000

 

試劑一

 

1000

試劑二

200

200

混勻,90℃水浴20min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻,于570nm波長處比色,△A=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

 

谷氨酸含量計算:

1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0074x- 0.5255;x谷氨酸含量(µg/mL),y吸光值。

2按照血清(漿)或者細胞培養(yǎng)液體積計算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣質量計算

谷氨酸含量(µg/g鮮重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

谷氨酸含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1:加入反應體系中樣本體積,1mL;V2:加入提取液體積,2 mL;V3:加入血清(漿)或細胞培養(yǎng)液體積,0.2 mL Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣質量,g1000:細菌或細胞總數(shù),1000萬。

 

注意:

1、該試劑盒僅適用于發(fā)酵液或組織中谷氨酸含量測定,檢測下限為100µg/mL。

2、標準曲線線性范圍為:100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA線性范圍為:0.01-2;若大于2則需要將上清液用試劑一稀釋至適當倍數(shù)后測定,計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。

 

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