正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
GS(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要儲存和運輸形式。
測定原理
GS在ATP和Mg2+存在下,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨酰基異羥肟酸,在酸性條件下形成的絡(luò)合物在540nm處有最大吸收峰,可用分光光度計測定。
所需的儀器和用品
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液:30mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:12mL×1瓶,-20℃保存,臨用前37℃預(yù)熱20min,充分混勻,如有沉淀,靜置10min,取上清待用。
試劑二:12mL×1瓶,-20℃保存,臨用前37℃預(yù)熱20min,充分混勻,如有沉淀,靜置10min,取上清待用。
試劑三:粉劑×2瓶,-20℃保存。用時每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。
試劑四:15mL×1瓶,4℃保存。
樣本測定的準(zhǔn)備
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管中加入下列試劑:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 400 |
|
試劑二 |
| 400 |
試劑三 | 175 | 175 |
樣本 | 175 | 175 |
混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴30min
試劑四 | 250 | 250 |
混勻,25℃室溫靜置10min后,5000g,25℃離心10min,取上清液測定540nm處的吸光值A。△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。
GS活力單位的計算
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.8348x + 0.0008,R2 = 0.9999
1、血清(漿)GS活性
單位定義:每mL血清(漿)在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨;惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
計算公式:
GS(μmol/h/mL)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V樣÷T
=10.268×ΔA
2、組織、細菌或細胞GS活性
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。
GS(μmol/h/mg prot)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=10.268×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨;惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS(μmol/h/g 鮮重)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=10.268×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨;惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS(μmol/h/104 cell)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.021×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.75mL; V樣:加入樣本體積,0.175mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。