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賴氨酸(LYS)測試盒微量法

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      正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

賴氨酸是人體必需氨基酸之一,能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能,并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。賴氨酸為堿性必需氨基酸。由于谷物食品中的賴氨酸含量甚低,且在加工過程中易被破壞而缺乏,故稱為第一限制性氨基酸。

 

測定原理:

蛋白質(zhì)中的賴氨酸具有一個(gè)游離的ε-NH2,它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì),其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴氨酸的含量成線性關(guān)系。亮氨酸與賴氨酸的碳原子數(shù)目相同,而且僅有—個(gè)游離氨基(ε-NH2),所以通常用亮氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水、水浴鍋

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入12.5mL試劑三充分溶解混勻;

試劑二:液體12.5mL×1瓶,4℃保存;

試劑三:液體15mL×1,4℃保存;

試劑四:60%乙醇,自備。

 

氨酸提。

樣本烘干粉碎,稱取0.01g樣本,加入1mL提取液,充分勻漿。80℃水浴提取20min,冷卻后10000g離心10min,取上清待測。

 

測定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至570nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液的配制:取10mL試劑一與10mL試劑二混合搖勻,取上清備用。用不完的試劑4℃保存

3、 在有蓋EP管中加入下列試劑:

試劑名稱(μL

測定管

空白管

樣本

200

 

提取液

 

200

工作液

400

400

混勻,80℃水浴30min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻至常溫。

試劑

600

600

混勻,取1000μL1mL玻璃比色皿中,于530nm波長處記錄吸光值A。△A=A測定管-A空白管。空白管只要做一管。

 

賴氨酸含量計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0062x - 0.0212x為賴氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

賴氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

賴氨酸含量(µg/g干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷W

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.2mL;V2:加入提取液體積,1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g1.1515,校正系數(shù)。

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