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堿性蛋白酶活性測(cè)定試劑盒微量法

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     意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

AKP是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類(lèi),屬于絲氨酸蛋白酶。此外,該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵,具有轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一,廣泛應(yīng)用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。

 

測(cè)定原理:

堿性條件下,AKP水解酪蛋白生成酪氨酸;堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍(lán);鎢藍(lán)在680nm有特征吸收峰,測(cè)定680nm吸光度增加速率,來(lái)計(jì)算AKP活性。

 

自備儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5 mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體90mL×1瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解。

試劑三:粉劑×1,4避光保存。臨用前加入20 mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱15-30分鐘,該試劑為過(guò)飽和試劑,充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。

試劑四:粉劑×1瓶, 4保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。

試劑五:液體10mL×1瓶,4保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1支,0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,4保存。

 

粗酶液提。

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g4離心10min,取上清,即粗酶液。

2. 血清或培養(yǎng)液:直接測(cè)定。

3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)

 

測(cè)定操作

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二、試劑三和試劑四置于40水浴保溫30min。

3. 對(duì)照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液(血清或培養(yǎng)液),200μL試劑二,混勻后置于40水浴保溫10min;加入200μL試劑三,混勻后8000g 4離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于40水浴保溫20min,于680nm測(cè)定光吸收,記為A對(duì)照管。

4. 測(cè)定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液(血清或培養(yǎng)液)200μL試劑三,混勻后置于40水浴保

 

10min;加入200μL試劑二,混勻后8000g 4離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于40水浴保溫20min,于680nm測(cè)定光吸收,記為A測(cè)定管。(注意與對(duì)照管不同,先加試劑三,后加試劑二)

5. 空白管:取一支EP管,加入200μL蒸餾水,1000μL試劑四200μL試劑五,混勻后置于40水浴保溫20min,于680nm測(cè)定光吸收,記為A空白管。

6標(biāo)準(zhǔn)管:取EP管,加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品,1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于40水浴保溫20min,于680nm測(cè)定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。

 

計(jì)算公式

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

AKP活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸1個(gè)酶活單位。

AKP活性(nmol/min /mg prot= C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

AKP活性單位定義:30每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸1個(gè)酶活單位

AKP活性(nmol/min /g鮮重=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷W×V1÷V2÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

3. 按照液體體積計(jì)算

AKP活性單位定義:30毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸1個(gè)酶活單位。

AKP活性(nmol/min/mL=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

4. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

AKP活性單位定義:30104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸1個(gè)酶活單位

AKP活性(nmol/min /104 cell=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;V反總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),0.1 mL;V2提取液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10minW:樣品質(zhì)量(g。

 

注意事項(xiàng):

臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。

 

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