中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性測定試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意: 正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
NP在一定的溫度和中性pH條件下,催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等特點(diǎn),中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。
測定原理:
中性條件下,NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán);在680nm有特征吸收峰。
自備儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體90mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入20 mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱15-30分鐘,該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。
試劑四:粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。
試劑五:液體10mL×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1支,0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,4℃保存。
粗酶液提。
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。
2. 血清或培養(yǎng)液:直接測定。
3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作:
1.分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到680 nm,蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。
3. 對(duì)照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL試劑二,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入200μL試劑三,混勻后8000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A對(duì)照管。
4. 測定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL試劑三,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入200μL
試劑二,混勻后8000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二)
5. 空白管:取EP管,加入200μL蒸餾水,1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A空白管。
6. 標(biāo)準(zhǔn)管:取EP管,加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品,1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。
計(jì)算公式:
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
NP活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
NP活性(nmol/min /mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
NP活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
NP活性(nmol/min /g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
3. 按照液體體積計(jì)算
NP活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
NP活性(nmol/min/mL)=C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
4. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
NP活性單位定義:30℃每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
NP活性(nmol/min /104 cell)=C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2)÷T= 125×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量
C標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;V反總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),0.1 mL;V2:提取液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10min;W:樣品質(zhì)量(g)。
注意事項(xiàng):
臨用前配制的試劑配制好后4℃保存,并且3天內(nèi)使用完畢。