【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:古典豬瘟、豬藍耳病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒(雙色實時熒光PCR法)
英文名稱:Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome、Classieal Swine Fever virus Detection Kit (Dual-channelReal-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于豬藍耳病毒和古典豬瘟病毒檢測,可用于臨床古典豬瘟病毒感染及豬藍耳病毒感染的輔助診斷,但不作確診使用。
【原 理】
本試劑盒針對豬藍耳及古典豬瘟病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,在反應體系中含豬藍耳及古典豬瘟病毒基因組模板的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結果的定性分析。
【古典豬瘟、豬藍耳病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒(雙色實時熒光PCR法)組成】
序號 | 組成 | 50T/盒 |
1 | PRRSV/CSFV RT-PCR反應液 | 875 μL×1管 |
2 | PRRSV/CSFV混合酶液 | 125 μL×1管 |
3 | PRRSV/CSFV陽性對照 | 40 μL×1管 |
4 | PRRSV/CSFV陰性對照 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 |
注:陰性對照為滅菌純水,陽性對照為含古典豬瘟、豬藍耳靶基因的質(zhì)粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
2.肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
3.應避免標本間交叉污染。
4.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-80℃以下,避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備(試劑準備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當次實驗所需要的反應數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預留量(1T)+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶液 | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備(樣本處理區(qū))
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR(PCR擴增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集豬藍耳病毒熒光信號 HEX通道采集古典豬瘟病毒熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 50℃:10分鐘(min) | 1 | |
預變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
PCR擴增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結束時采集熒光信號) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標本結果判定:
(1)陽性:標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標本檢測結果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 | |
FAM | HEX | |
+ | + | |
+ | - | 標本中檢測出豬藍耳病毒RNA,未檢測出古典豬瘟病毒RNA |
- | + | 標本中檢測出古典豬瘟病毒RNA,未檢測出豬藍耳病毒RNA |
- | - | 標本中未檢測出豬藍耳病毒RNA、古典豬瘟病毒RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結果。
【古典豬瘟、豬藍耳病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒(雙色實時熒光PCR法)性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為103 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室,應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理;
2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理;
3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染;檢測結束后,應立即對工作臺清潔;
4. 吸取反應液時,應盡量避免產(chǎn)生氣泡;上 PCR 儀前,應注意檢查各反應管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結果不準確;
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心;
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放;
7. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記;
8. 檢測過程中使用過的吸頭,應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結束的PCR 反應管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄;工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒;
9. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用;并在有效期內(nèi)使用。