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恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

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 1 原理及用途

恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測蜂蜜、動(dòng)物組織(雞肉、豬肉、魚、蝦)、牛奶、奶粉和雞蛋等樣本中的恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的恩諾沙星和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含恩諾沙星含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中恩諾沙星的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:0.2ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,45min15min

2.3 檢測下限:

組織(雞肉、豬肉、魚、蝦) ………0.6ppb

蜂蜜 ……………………………………0.8ppb

牛奶 ……………………………………6ppb

奶粉 ……………………………………10ppb

雞蛋 ……………………………………6ppb

尿樣 ……………………………………1ppb

血清 ……………………………………6ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

恩諾沙星………………………………100%

噁喹酸…………………………………28%

左氧氟沙星……………………………10%

洛美沙星………………………………4%

麻保沙星………………………………4%

沙拉沙星………………………………2%

 2.5 樣本回收率:

組織、蜂蜜、牛奶、奶粉、雞蛋、血清……85%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):100ppb …………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)……………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋)…………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

5×復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說明書 ………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:無水乙腈、正己烷、濃HCl

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:0.15M鹽酸溶液

    5ml濃鹽酸,加入去離子水混勻,定容至400ml。

配液2:樣本提取液

    量取10ml 0.15M鹽酸溶液(配液1)加入到90ml無水乙腈中混合均勻。

配液3:1×復(fù)溶液

5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋(1份復(fù)溶液加4份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

配液4:工作洗滌液

    濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1 動(dòng)物組織(雞肉、豬肉、魚、蝦)處理方法

1)稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中;

2)加入8ml樣本提取液(配液2),振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;

3)取2ml清澈上層有機(jī)相至潔凈干燥的10ml玻璃試管中,50-60℃水浴氮?dú)獯蹈桑?/span>

4)加入1ml正己烷,振蕩2分鐘,再加1ml復(fù)溶液(配液3),振蕩30秒,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;

5)去除上層正己烷,取下層水相50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):2    檢測下限:0.6ppb

5.3.2 蜂蜜處理方法

1)取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中,加6ml樣本提取液(配液2),振蕩5分鐘,使其充分溶解;

2)加入3ml復(fù)溶液(配液3),加入11ml二氯甲烷,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘;

3吸去上層,取下層有機(jī)相8ml至干燥容器中,50-60℃水浴氮?dú)獯蹈桑?/font>

41ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物,再加入正己烷1ml混合30秒,室溫3000轉(zhuǎn)/分以上,離心5分鐘;

5去除上層取下層50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):2    檢測下限:0.8ppb

5.3.3 牛奶處理方法:

1)取25µl樣本液與475µl復(fù)溶液(配液3)混合,振蕩1分鐘,使其充分溶解;

2)取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):20    檢測下限:6ppb

5.3.4 奶粉處理方法:

1)稱取0.5±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中,加入5ml去離子水,振蕩,使其充分溶解;

2)取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液(配液3)混合,振蕩1分鐘;

3)取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):50    檢測下限:10ppb

5.3.5 雞蛋處理方法:

1)稱取1.0±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中,加入5ml去離子水,振蕩,使其充分溶解;

2)取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液(配液3)混合,振蕩1分鐘;

3)取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):30    檢測下限:6ppb

5.3.6 尿樣本處理方法

1)用4ml 1×復(fù)溶液1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合,混合30s;

2)取50µl液體用于分析。  

樣本稀釋倍數(shù): 5    檢測下限:1ppb

5.3.7 血清處理方法

1)取50µl血清樣本與1450µl復(fù)溶液(配液3)混合,振蕩1分鐘;

2)取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 30    檢測下限:3ppb 

恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

6.1    號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3    滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間

6.5     止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即

 百分吸光度值(%)=

A

×100%

A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。

質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

 

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