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呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

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 1 原理及用途

呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測蜂蜜、魚、蝦、禽、肝臟等中的呋喃妥因代謝物(AHD),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的呋喃妥因代謝物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃妥因代謝物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含呋喃妥因代謝物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:0.02ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,45min15min

2.3 檢測下限:

組織、肝臟、雞蛋…………………0.04ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.04ppb

奶粉、飼料、蛋粉…………………0.04ppb

熟食…………………………………0.04ppb

/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾,定量下限為0.06ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

呋喃妥因代謝物…………………100%

呋喃唑酮代謝物…………………<0.1%

呋喃西林代謝物…………………<0.1%

呋喃它酮代謝物…………………<0.1%

2.5 樣本回收率:

組織、肝臟、雞蛋…………………85±25%

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………80±20%

奶粉、飼料、蛋粉…………………85±25%

熟食…………………………………80±20%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、0.02ppb、0.06ppb、0.18ppb、0.54ppb、1.62ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):100ppb…………1ml

衍生化試劑(黑蓋) ………………10ml

酶標(biāo)記物(紅蓋) …………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋) ………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

2×復(fù)溶液(黃蓋) …………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、濃HCl、K2HPO4·3H2O、亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5(NO)2H2O)、硫酸鋅ZnSO4·7H2O、乙腈、甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:0.36M亞硝基鐵氰化鈉溶液(牛奶、奶粉樣本)

10.7g亞硝基鐵氰化鈉加去離子水混勻溶解,定容至100ml。

配液2:1.04M硫酸鋅溶液(牛奶、奶粉樣本)

    29.8g硫酸鋅加去離子水混勻溶解,定容至100ml。

配液3:0.1M  K2HPO4 溶液

    11.4g K2HPO43H2O加去離子水混勻溶解,定容至500ml。

配液4:1M  HCL

    8.6mL濃HCL加去離子水定容至100mL。

配液5:1M  NaOH溶液

    稱取4g NaOH,加去離子水混勻溶解,定容至100ml。

配液6:復(fù)溶液

2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋(1份復(fù)溶液加1份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

配液7:工作洗滌液

    濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1 牛奶樣本處理方法

1)取5ml樣本于離心管中,加250ul 亞硝基鐵氰化鈉溶液(配液1)振蕩混合30秒,加250ul 硫酸鋅溶液(配液2)振蕩混合30秒,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;

2)取上清1.1ml,加4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘;

3)在37℃過夜孵育(約16小時(shí))或50℃(超過50℃時(shí)會(huì)影響分層效果)水浴孵育3小時(shí);

4)分別加入5ml 0.1M K2HPO4 溶液,0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯,振蕩5分鐘;

5)室溫下4000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘;

6)取出2.5ml的上層液到另一個(gè)離心管中,50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

7)用1ml正已烷溶解殘留物,加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒;室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘;

8)去除上層正已烷,取50μl下層液用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測下限:0.04ppb

5.3.2 奶粉、蛋粉樣本處理方法

1)稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中,加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘;

2)在37℃過夜孵育(約16小時(shí))或50℃(超過50℃時(shí)會(huì)影響分層效果)水浴孵育3小時(shí);

3)250ul 亞硝基鐵氰化鈉溶液(配液1)振蕩混合30秒,加250ul 硫酸鋅溶液(配液2)振蕩混合30秒,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;

4)取全部上清到另一個(gè)離心管中,后續(xù)接5.3.1 牛奶樣本處理方法,4)

樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測下限:0.04ppb

5.3.3 蜂蜜、組織、腸衣、肝臟、飼料、雞蛋樣本處理方法

1)稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中,加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘;

2)后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,3)

樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測下限:0.04ppb

5.3.4 熟食樣本處理方法

1)稱取1±0.05g均質(zhì)樣于50ml離心管中,加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水,振蕩2min,室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,去除全部液體;

2)加入5ml乙腈和5ml正己烷,振蕩2min,室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,去除全部液體;

3)在沉淀中加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘;

    注:熟食的添加回收試驗(yàn)請?jiān)诖瞬郊尤敫邩?biāo)準(zhǔn)。

4)后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,3)

樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測下限:0.04ppb

呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

6.1    號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3    滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間。

6.5     止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即

 百分吸光度值(%)=

A

×100%

A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索。

呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。

質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

 

 

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