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三聚氰胺檢測(cè)試劑盒

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 1 原理及用途

三聚氰胺檢測(cè)試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)奶粉、牛奶、組織、飼料、蛋類、血清等樣本中的三聚氰胺(Melamine,MEL),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液,樣本中的三聚氰胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗三聚氰胺抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含三聚氰胺含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三聚氰胺的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:2ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,30min15min

2.3 檢測(cè)下限:

奶粉……………………………………40ppb

牛奶……………………………………54ppb

牛奶/奶粉(處理法二)………………2ppb

組織(雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟)………4ppb

飼料……………………………………200ppb

蛋類……………………………………40ppb

血清……………………………………8ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

三聚氰胺………………………………100%

三聚氰酸………………………………60%

三嗪、三嗪二銨………………………<1%

 2.5 樣本回收率:

牛奶、奶粉………………………90%±20%

組織………………………………85%±20%

飼料………………………………85%±20%

蛋類………………………………80%±20%

3 三聚氰胺檢測(cè)試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):1ppm…………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋)………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

2×復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說(shuō)明書 ………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:?jiǎn)蔚?0µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、正己烷、甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:1M HCl 溶液

    8.6ml濃HCl加去離子水混勻,定容至100ml。

配液2:乙腈-0.1M NaOH溶液

    84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。

配液3:0.1M NaOH 溶液

    稱取0.4g NaOH加去離子水混勻溶解,定容至100ml。

配液4:1M NaOH 溶液

    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。

配液5:復(fù)溶液

2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋(1份2×復(fù)溶液加1份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

配液6:工作洗滌液

    濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。 

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1 牛奶專用樣本處理方法:

1)取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中,加入1ml乙腈,充分振蕩混勻;4000r/min離心5min;

2)取100µl上清液,加入900µl復(fù)溶液,混勻;

3)取50 µl用于分析。

牛奶樣本稀釋倍數(shù):27    檢測(cè)下限:54ppb

5.3.2 奶粉專用樣本處理方法:

1)稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中,加入4ml甲醇,充分振蕩;

2)4000r/min離心10min,取100µl上清液,再加入900µl復(fù)溶液,混勻;

3)取50µl用于分析。

奶粉樣本稀釋倍數(shù):20    檢測(cè)下限:40ppb

5.3.3 牛奶/奶粉樣本處理方法二:

1)取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中;

2)加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,4000r/min離心10min,取4ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮?/span>

3)用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml復(fù)溶液,混合30s,離心去除上層正己烷相;

4)取下層水相50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù):1    檢測(cè)下限:2ppb

5.3.4 組織(雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟)樣本處理方法:   

1)取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中;

2)加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,4000r/min離心10min,取2ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮?/span>

3)用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml復(fù)溶液,混合30s,離心去除上層正己烷相;

4)取下層水相50µl用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù):2    檢測(cè)下限:4ppb

5.3.5 飼料樣本處理方法:

1)將飼料樣品研碎,稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品,加入2ml 1M HCl,加入16ml去離子水均質(zhì);

2)旋流1min,放振蕩器上振蕩2min;

3)4000r/min離心15min,取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。(注:因飼料樣品的不同,加入1M NaOH的量有所差異,根據(jù)情況調(diào)節(jié),一般加入范圍是0.5ml—1ml之間)

4)4000r/min 離心15min,吸出上清液(如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾);

5)取上清液用復(fù)溶液10倍稀釋(取100µl上清液加入900µl復(fù)溶液,混合均勻);

6)取50µl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù):100    檢測(cè)下限:200ppb

5.3.6 蛋類樣本處理方法:   

1)用均質(zhì)器低速均勻樣本(蛋清、蛋黃或全蛋);

2)稱取2.0±0.05g均質(zhì)過(guò)的樣本,加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min;(蛋清含蛋白成份高,加入提取液后會(huì)形成一團(tuán)膠狀物,較蛋黃或全蛋難搖勻,此情況為正,F(xiàn)象不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)

3)4000r/min離心10min,取1ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮? 

4)用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml復(fù)溶液,混合30s,離心去除上層正己烷相;

5)取下層水相用復(fù)溶液4倍稀釋(50µl樣本液加150µl復(fù)溶液),混合30s;

6)取50µl用于分析。

 樣本稀釋倍數(shù):20    檢測(cè)下限:40ppb

5.3.7 血清樣本處理方法:   

1)取0.5ml血清樣本于50ml離心管中;

2)加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,4000r/min離心10min,取1ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮?/span>

3)用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml復(fù)溶液,混合30s,離心去除上層正己烷相;

4)取下層水相50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):4    檢測(cè)下限:8ppb

三聚氰胺檢測(cè)試劑盒酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

6.1    號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3    滌:小心揭開(kāi)蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干。(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過(guò)淺,可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間)。

6.5     止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測(cè)吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm)。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即

 百分吸光度值(%)=

A

×100%

A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過(guò)程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。

8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。

質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。

 

 

 

 

 

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