1 磺胺十七合一檢測(cè)試劑盒原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液等樣本中的磺胺類(lèi)藥物(Sulfonamides,SAs),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的磺胺類(lèi)藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺類(lèi)藥物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含磺胺類(lèi)藥物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類(lèi)藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度:0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式:25℃,45min~15min
2.3 檢測(cè)下限:
組織(高檢測(cè)限方法)……………0.5ppb
組織(低檢測(cè)限方法)……………2.5ppb
血清、尿液…………………………2ppb
蜂蜜…………………………………0.5ppb
牛奶…………………………………10ppb
雞蛋…………………………………1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率:
藥物名稱(chēng) | 交叉率 | 靈敏度ppb |
磺胺二甲基嘧啶(SM2) | 100% | 0.5 |
磺胺間甲氧嘧啶(SMM) | 670% | 0.07 |
磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMD) | 582% | 0.09 |
磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM') | 451% | 0.1 |
磺胺甲基嘧啶(SM1) | 313% | 0.15 |
磺胺嘧啶(SD或SDZ) | 308% | 0.15 |
磺胺二甲異嘧啶(SM2') | 241% | 0.2 |
磺胺間二甲氧嘧啶(SDM) | 175% | 0.3 |
磺胺甲噻二唑(SMT) | 165% | 0.3 |
磺胺氯吡嗪(Esb3) | 67% | 0.8 |
磺胺噻唑(ST) | 58% | 0.9 |
磺胺氯噠嗪(SCPA) | 58% | 0.9 |
磺胺甲氧噠嗪(SMP) | 57% | 0.9 |
磺胺二甲氧噠嗪(SDT) | 60% | 0.8 |
磺胺喹噁啉(SQX) | 42% | 1 |
磺胺異噁唑(SIZ) | 18% | 3 |
磺胺甲噁唑(SMZ) | 18% | 3 |
2.5 樣本回收率:
組織、蜂蜜………………………95±25%
尿樣、牛奶、血清、雞蛋………………85±25%
3 磺胺十七合一檢測(cè)試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):1ppm ……………1ml
酶標(biāo)記物(紅蓋)……………………5.5ml
抗體工作液(藍(lán)蓋)…………………5.5ml
底物液A(白蓋)……………………6ml
底物液B(黑蓋)……………………6ml
終止液(黃蓋)………………………6ml
20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml
2×復(fù)溶液(黃蓋) …………………50ml
說(shuō)明書(shū)…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個(gè)
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)
4.2 微量移液器:?jiǎn)蔚?0µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑:乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCL 、NaH2PO4·2H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知:
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液:
配液1:0.2M NaOH溶液
稱(chēng)取0.8gNaOH加入去離子水混勻溶解,定容至100ml。
配液2:0.02M PB緩沖液
稱(chēng)取2.58g Na2HPO4·12H2O和0.44g NaH2PO4·2H2O加去離子水混勻溶解,定容至500ml。
配液3:0.5M鹽酸溶液
4.3ml濃HCL加入去離子水混勻,定容至100ml。
配液4:復(fù)溶液
將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋(1份復(fù)溶液加1份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
配液5:工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟:
5.3.1組織樣本(高檢測(cè)限)處理方法
1)稱(chēng)取3±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中,加入3ml 0.02M PB緩沖液充分振蕩混勻,再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈,充分振蕩10min,于4000r/min以上速度離心10min;
2)移取2ml上層液體(約相當(dāng)于1g的樣本)在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?
3)加1ml正己烷溶解干燥的殘留物,再加1ml復(fù)溶液,強(qiáng)烈振蕩1min,4000r/min,離心5min;
4)除去上層正己烷,取下層水相50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測(cè)下限:0.5ppb
5.3.2 組織樣本(低檢測(cè)限)處理方法
1)稱(chēng)2.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中;加入8ml 0.02M PB緩沖液,震蕩2min,4000r/min以上離心10min;
2)取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 5 檢測(cè)下限:2.5ppb
5.3.3血清樣本處理方法
1)將血樣本于室溫放置30min,于4000r/min以上離心10min,分離出血清或過(guò)濾血清;
2)取1ml血清,加入3ml 0.02 M PB緩沖液混合,混合30s;
3)取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):4 檢測(cè)下限:2ppb
5.3.4 蜂蜜樣本處理方法
1)稱(chēng)取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中,加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min;
2)加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min,4000r/min以上室溫離心10min;
3)取2ml上層液體于50-60℃下氮?dú)獯蹈,?.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶,混合30s;
4)取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測(cè)下限:0.5ppb
5.3.5 尿樣本處理方法
1)用3ml 0.02 M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合,混合30s;
2)取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4 檢測(cè)下限:2ppb
5.3.6牛奶樣本處理方法
1)將牛奶樣本用0.02 M PB緩沖液20倍稀釋?zhuān)ㄈ?0µl牛奶+380µl 0.02 M PB緩沖液),混合30s;
2)取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):20 檢測(cè)下限:10ppb
5.3.7 雞蛋樣本處理方法
1)用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本,使蛋清和蛋黃充分混合;
2)稱(chēng)取2.0±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本(蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋)至50ml離心管中,加入8ml乙腈,立即用振蕩器振蕩10min,室溫4000r/min以上離心5min;
3)移取2ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于,在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
4)加入1ml正己烷,用渦旋儀渦動(dòng)30s溶解干燥的殘留物,再加入1ml復(fù)溶工作液,用渦旋儀渦動(dòng)1min,室溫4000r/min以上離心5min;
5)去上層有機(jī)相,取下層水相50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2 檢測(cè)下限:1ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
6.1 編 號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘。
6.3 洗 滌:小心揭開(kāi)蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
6.4 顯 色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過(guò)淺,可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間)。
6.5 終 止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm)。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)= | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索。
8 磺胺十七合一檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。
保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。