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哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒

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哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒pVAI RNA是一種通過表達(dá)Virus associated RNA I (VAI RNA)以抑制PKR被dsRNA激活,從而在哺乳動物細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染時促進(jìn)目的蛋白翻譯和表達(dá)的輔助質(zhì)粒。pVAI RNA也可以用于在慢病毒包裝時,通過增強(qiáng)病毒外殼蛋白的表達(dá),從而提高病毒的產(chǎn)量。pVAI RNA質(zhì)粒帶有氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因,可利用其氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性克隆。

哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì);蚋腥静《颈磉_(dá)目的蛋白時,經(jīng)常遇到目的蛋白表達(dá)量偏低的情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì);蚋腥静《竞,通常會轉(zhuǎn)錄生成大量的RNA,其中部分會形成雙鏈RNA (dsRNA),dsRNA會激活蛋白激酶R (Protein kinase R, PKR,也稱作DAI、p68 kinase、dsI、PKds、P1/eIF2α protein kinase)。PKR是哺乳動物細(xì)胞抗病毒防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一,被dsRNA激活的PKR可以磷酸化轉(zhuǎn)錄起始因子eIF-2α (Eukaryotic initiation factor 2α),從而抑制mRNA的翻譯和蛋白的表達(dá)[1]。pVAI RNA與帶有目的基因的表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時,細(xì)胞中的RNA聚合酶III (RNA polymerase III)能夠轉(zhuǎn)錄pVAI RNA質(zhì)粒上的腺病毒編碼的病毒相關(guān)RNA (Virus associated RNA I, VAI RNA),VAI RNA能夠與PKR結(jié)合并抑制其被dsRNA激活,從而增強(qiáng)目的蛋白的表達(dá)[2-3]。VAI RNA也被發(fā)現(xiàn)可以用于在慢病毒包裝時提高包裝產(chǎn)生的病毒滴度[4]。VAI RNA促進(jìn)蛋白翻譯和表達(dá)的工作原理如下圖所示。

 

 

 

圖1. pAVI RNA (哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒)工作原理圖。

pVAI RNA與表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞增強(qiáng)目的蛋白表達(dá)水平的效果取決于多種參數(shù),包括細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)染方法和pVAI RNA載體與表達(dá)質(zhì)粒的使用比例(建議1:10-1:1)等。這些參數(shù)的優(yōu)化對獲得比較理想的增強(qiáng)至關(guān)重要。

pVAI RNA質(zhì)粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
Adenovirus type 2 genome 1-1724
Adenovirus VAI RNA gene 780-939
Adenovirus VAII RNA gene 1036-1198
lac operator 1767-1783
lac promoter 1791-1821
CAP binding site 1836-1857
ori 2145-2733
Ampicillin resistance gene 2904-3764
Ampicillin promoter 3765-3869

哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒pVAI RNA質(zhì)粒(4392bp)的圖譜如下:

pVAI RNA質(zhì)粒中推薦使用的測序引物序列如下:

M13-F (4342-4359): 5'-TGTAAA ACGACGGCCAGT-3'

M13-R (1742-1759): 5'-CAGGAA ACAGCT ATGACC-3'

pVAI RNA的全序列信息:D3019 pVAI RNA-全長序列.txt。請聯(lián)系客服發(fā)送。

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  pVAI RNA (哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒) 1µg
  pVAI RNA (哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒) 100µg
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