一、細(xì)胞培養(yǎng)條件
培養(yǎng)條件 | 空氣,95%;CO2,5% ;37℃ | ||
生長(zhǎng)特性 | 貼壁生長(zhǎng) | 凍存條件 | 無血清凍存液 |
培養(yǎng)體系 | 1640 + 10%FBS + 1%P/S | ||
傳代方法 | 建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
備注 | 用無菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基,留作過渡對(duì)比培養(yǎng) 如果對(duì)比培養(yǎng)效果不好,建議直接購買我們的完全培養(yǎng)基 |
二、細(xì)胞收貨后處理
A、復(fù)蘇細(xì)胞處理方法:培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶,嚴(yán)格無菌后將細(xì)胞瓶放置培養(yǎng)箱中靜置2-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。靜置后顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存(最好40x,100x,200x各一張),前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。
B、凍存細(xì)胞處理方法:收到細(xì)胞后,觀察泡沫箱中干冰是否有剩余,凍存管是否完好無損是否有解凍情況,若發(fā)現(xiàn)干冰完全汽化或凍存管有解凍破損現(xiàn)象,請(qǐng)及時(shí)拍照并與我們聯(lián)系。如果細(xì)胞簽收三天內(nèi)未與我們聯(lián)系,則默認(rèn)為收貨良好。復(fù)蘇第一管如有活性問題,請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們,技術(shù)人員與您溝通指導(dǎo)后再復(fù)蘇第 二管,未與我方聯(lián)系擅自復(fù)蘇第二管出現(xiàn)問題不予售后。
三、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
a、細(xì)胞傳代:如細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),步驟如下:
1) 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次;
2) 加1-2mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置培養(yǎng)箱中消化 1-2min ,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后,加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化;
3) 輕輕吹打細(xì)胞,完全脫落后吸出至離心管中,1000 rpm離心5-8min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基后吹勻;
4) 按5-6mL每瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中或者T25培養(yǎng)瓶中。
(即1個(gè)T25瓶傳代接種至2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm的培養(yǎng)皿)
b、細(xì)胞凍存:細(xì)胞收集參照傳代步驟,按凍存數(shù)量(推薦每支凍存管5×106左右細(xì)胞數(shù)量?jī)龃?/span>),加入1ml的我司無血清凍存液(貨號(hào):C7001),輕輕混勻后,放-80℃冰箱,24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮罐中。
C、細(xì)胞復(fù)蘇:從液氮灌或-80℃冰箱中找到需要復(fù)蘇的細(xì)胞,水浴鍋提前打開預(yù)熱37℃。
1) 將凍存細(xì)胞在37℃水浴中迅速搖晃解凍;
2) 將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的離心管中,1000 rpm離心5min;
3) 棄去上清液,補(bǔ)加5mL完全培養(yǎng)基后吹勻,接種于T25培養(yǎng)瓶中或6cm皿中,培養(yǎng)過夜,第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
四、注意事項(xiàng):有些細(xì)胞貼壁不牢,在運(yùn)輸過程中細(xì)胞容易脫落,這是正常現(xiàn)象。如脫落較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5-8min,收集上清作過渡培養(yǎng),沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代,補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-6ml/瓶,最后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。