一、產(chǎn)品描述

hiPSC-CAS9細胞株是將含Cas9蛋白基因的載體轉染進hiPSC細胞中，通過藥物篩選，得到長期穩(wěn)定表達的hiPSC-CAS9穩(wěn)轉細胞株。貼壁生長，呈克隆狀，半藥濃度H=50ug/mL，可在hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中快速增殖。包裝規(guī)格為1mL凍存管，含量為>1x106個/mL，且支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性。

該細胞株穩(wěn)定表達Cas9核酸酶，通過轉染 gRNA可實現(xiàn)基因敲除，轉染 gRNA 和供體 DNA，可實現(xiàn)基因敲入/點突變。細胞系在體外長期培養(yǎng)可能導致部分細胞基因組發(fā)生改變，可能會降低 Cas9 的表達。因此，我們提供低代次(10 代以內(nèi))的細胞，保證實驗效果。

為了維持 Cas9 基因表達量的穩(wěn)定，建議傳代時使用半藥培養(yǎng)。

二、試劑準備

1)hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 在生物安全柜中，使用無菌移液管將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 與hESC/iPSC Basal Medium 混勻配制成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后根據(jù)使用情況將培養(yǎng)基分裝，封口膜封好，確保置于 4℃儲存的培養(yǎng)基 2 周內(nèi)使用完畢，其余培養(yǎng)基于-20℃冷凍保存，需要時提前于 4℃過夜解凍。

2)Matrigel鋪板(以Corning® Matrigel®包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準備18個無菌1.5 mL EP管，標記Matrigel日期、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架，均置于-20℃冰箱中預冷1小時。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍，當Matrigel完全解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導致分裝體積不準時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準備4個6孔板，標記Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預冷吸頭向解凍過的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用，或置于4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用，急用時可放置培養(yǎng)箱 40 分鐘。

三、細胞培養(yǎng)操作

1)復蘇hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預熱至37℃;并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫。

2.取 2 mL hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，加入 4uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為10uM，取 9mL DMEM/F12，加入 18uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM，恢復至室溫。

注意：不要在37℃水浴鍋中預溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準備好的 15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入 9mL DMEM/F12，將離心管輕輕緩慢上下顛倒混勻，160g離心 5 min。

5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基。

6. 離心完吸棄上清，至留下 50uL 左右的上清，輕彈管底 3-4 下至細胞混勻在上清中，逐滴緩慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，輕彈管底 3-4 下混勻細胞，將這 1mL 細胞懸空滴加進 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中。

7. 水平十字搖勻三次，置于 37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

注：水平十字搖勻 3 次，左右兩次+上下兩次算一次。

8. 18-24 小時后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

表1：hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

表1：hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

2)傳代hESC/iPSC(以6孔板為例)

圖 1：傳代第 1 天和第 4 天的細胞狀態(tài)（A）hiPSC CAS9 4 倍鏡下第 1 天的狀態(tài)；（B）hiPSC CAS9 4 倍鏡下第4 天的狀態(tài)；（C）hiPSC CAS9 10 倍鏡下第 1 天的狀態(tài)；（D）hiPSC CAS9 10 倍鏡下第 4 天的狀態(tài)。

1. 傳代條件：① 細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫(~25℃)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C終濃度10uM，恢復至室溫(~25℃)。

5. 將細胞六孔板孔內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入 1 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃后吸棄。

6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆蓋孔底。

7. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 5-7 min。

注：

① 消化 5-7 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；hiPSC CAS細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution（<10 min）。

② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。

圖 2：消化 hiPSC CAS9 細胞不同時間形態(tài)圖：（A）消化 6 min 低倍鏡 hiPSC CAS9 培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化 7min低倍鏡 hiPSC CAS 培養(yǎng)的的形態(tài)圖。

8.消化時，吸棄含有 Matrigel 的鋪板培養(yǎng)基

9. 消化結束后，輕輕拍打板側（每側拍兩下），把細胞拍下來，再在生物安全柜中，加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基終止消化，把這 2mL 體系吸入 15mL 離心管離心 200g 1min，吸棄上清至剩余幾十微升，輕彈孔底 3-4 下，讓細胞沉淀溶于上清，往孔板里加 2mL 培養(yǎng)基，再加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基到含有細胞的 15mL 離心管里，輕彈 3-4下，混勻即可，把這一毫升細胞懸液懸空滴加入板里的培養(yǎng)基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人，水平十字搖勻 3 次。

注：可將傳完代后的細胞在鏡下觀察細胞密度，根據(jù)密度調整是否需要多加細胞滴。

10.置于 37℃，5% CO2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻 3 次，不要疊放。

11. 18-24 小時后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，此后每天換液，第 4 天繼續(xù)傳代/凍存。

注：傳代后隔天算第 1 天。

3)凍存hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 當細胞匯合度達85%左右(如圖1(B-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準備相應數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標記細胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入1 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計時5-7 min(可參考“三（2）、傳代hESC/iPSC”步驟)。

6. 消化結束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸棄hESC/iPSC Passage Solution。

7.混勻含有終濃度為 10uM 的 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL，輕柔吹打，隨后吸取細胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉入液氮罐中長期保存。

四、收貨注意事項

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運輸?shù)募毎麢z查干冰是否完全揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復蘇細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸?shù)脑�因，細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

5. 該細胞僅供科研使用。