細(xì)胞背景：hPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是從人類多能干細(xì)胞（hPSC）分化得來(lái)，該細(xì)胞是分化早期的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，具有繼續(xù)向成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（mMN）分化的能力。分化獲得的成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（mMN）能表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特異性Marker（如CHAT, MAP2等）

培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1 mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 4 mLNSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基（含 10μM Y-27632）混合均勻。在 1000 rpm 條件下離心 3 min，棄去上

清液，加 1-2 mL NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基（含 10μM Y-27632）后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量 NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基（含 10μM Y-27632）的低吸附六孔板（1 孔）或低吸附 35mm 皿

中培養(yǎng)過(guò)夜。24h 后，100g 離心棄去上清，換成不含 Y-27632 的 NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基，視培養(yǎng)基顏色或隔 2 天半量換液。

2）細(xì)胞傳代：當(dāng)神經(jīng)球直徑達(dá) 100-150μm 時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1、100g 離心棄去上清，加入 1-2 mL Accutase（含 10μM Y-27632），置于 37℃水浴消化 10-15 min。

2、10-15 min 后每孔加入等量 NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞解離成小團(tuán)塊或單細(xì)胞。

3、將細(xì)胞懸液收集到 15 mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。

4、仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用 1mL 恢復(fù)室溫的 NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保細(xì)胞溶液均勻。

5、使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，使用 NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基稀

釋細(xì)胞，將細(xì)胞以 5×105/mL（或 1:2-1:3 比例）接種到低吸附六孔板中。

細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面以低吸附 T25 為例；

1、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入離心管中，100g 離心 5 min，棄上清液，加入 2 mLAccutase（含 10μM Y-27632）水浴消化 15 min，。

2、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清凍存液，使細(xì)胞密度 1×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存 1mL 細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h 后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用 75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正�，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將 T25瓶置于 37℃培養(yǎng)箱放置 2-4h。

4. 客戶可購(gòu)買NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基（含 NSPC 擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基；NSPC 擴(kuò)增培養(yǎng)基補(bǔ)充劑）。

5. 建議客戶收到細(xì)胞后前 3 天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑�因，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問(wèn)題解決。

6.該細(xì)胞僅供科研使用。

7. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。

8. 注意： 1:2 傳代就是 1 個(gè) T25 瓶傳 2 個(gè) T25 瓶或者 1 個(gè)六孔板（或按照底面積換算），必須使用低吸附培養(yǎng)器皿，或經(jīng)過(guò)特殊液體潤(rùn)洗使得細(xì)胞難以貼于培養(yǎng)器皿表面。