一 、產(chǎn)品詳情
中文名稱(chēng)：EGFRvIIIt過(guò)表達(dá)K562單克隆細(xì)胞株
穩(wěn)轉(zhuǎn)基因名稱(chēng)：Homosapiensepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR),transcriptvariantEGFRvIII(序列：NM_001346941.2)EGFRvIIIt：EGFRvIII基因缺失胞內(nèi)段的突變體。
熒光蛋白：RFP
1.親株細(xì)胞系：該細(xì)胞是由Lozzio從一名53歲的慢性髓細(xì)胞性白血病急變期的女性患者的胸水中分離建立的。該細(xì)胞曾被認(rèn)為來(lái)源于粒系，處于高度未分化階段；Anderson等人作了細(xì)胞膜特性的研究后，認(rèn)為該細(xì)胞是紅白血病細(xì)胞系。該細(xì)胞是對(duì)自然殺傷細(xì)胞高度敏感的體外靶標(biāo)，故而被廣泛應(yīng)用于這方面的研究。K562的原始細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的造血系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞，能自發(fā)分化為紅系、粒系和單核系的可辨識(shí)的祖細(xì)胞。
2.過(guò)表達(dá)基因EGFRvIII：EGFRvIII是表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的2～7 外顯子缺失形成的突變體。據(jù)報(bào)道，約5%的人肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中存在EGFRvIII突變。EGFRvIII可能在人NSCLC腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。吉非替尼、厄洛替尼和HKI-272等藥物可抑制EGFRvIII轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖和EGFRvIII陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。
3.EGFRvIIIt：EGFRvIII全長(zhǎng)基因缺失胞內(nèi)段的突變體。
4.K562-RFP-Puro+EGFRvIIIt 單克隆細(xì)胞株：該細(xì)胞株是由慢病毒Lenti-RFP-Puro+EGFR vIIIt轉(zhuǎn)導(dǎo)K562細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選和無(wú)限稀釋法篩選構(gòu)建而成，該細(xì)胞能在體外穩(wěn)定過(guò)表達(dá)EGFRvIIIt和RFP。
5.細(xì)胞株質(zhì)檢：該單克隆細(xì)胞株在本庫(kù)通過(guò)支原體檢測(cè)，其親代細(xì)胞在本庫(kù)通過(guò)STR鑒定。
6.應(yīng)用領(lǐng)域：CART的免疫治療靶點(diǎn)。
| 傳代方法 | 1:2~1:4傳代，每2～3天傳代或換液一次。 | 凍存條件 | 細(xì)胞庫(kù)無(wú)血清凍存液 |
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細(xì)胞株構(gòu)建流程
| 1.構(gòu)建目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒，并包裝慢病毒； 2.慢病毒以合適的MOI值轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞； 3.用最佳濃度藥物對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得混合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株； 4.采用無(wú)限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞株； 5.單克隆細(xì)胞株質(zhì)檢（COA）。 | ||
| 細(xì)胞備注 | 如混合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株帶抗性基因，建議每傳8～10代用相應(yīng)抗性藥物篩選一次(12μg/mL)；或在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加適當(dāng)濃度的抗性藥物以維持細(xì)胞株陽(yáng)性率(1.2μg/mL)。 | ||
二、細(xì)胞到貨處理
常溫到貨細(xì)胞:T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶寄送活細(xì)胞（細(xì)胞處于培養(yǎng)液中）的處理方法
1.觀(guān)察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象。若有，請(qǐng)拍照，并及時(shí)與技術(shù)支持聯(lián)系。
2.用75%酒精擦拭細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。若因運(yùn)輸問(wèn)題，部分貼壁細(xì)胞從瓶壁脫落,先不要打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2～4小時(shí)，以便穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。
3.靜置完成后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鏡檢、拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)，如有異常現(xiàn)象，例如污染，細(xì)胞狀態(tài)差等，請(qǐng)拍照留證并及時(shí)與技術(shù)支持聯(lián)系。
4.僅留適量細(xì)胞培養(yǎng)液（棄去多余），然后將細(xì)胞置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
5.根據(jù)細(xì)胞習(xí)性及時(shí)換液、傳代、凍存細(xì)胞。
凍存管寄送活細(xì)胞（細(xì)胞處于全血清中）的處理方法：
1.用75%酒精徹底消毒細(xì)胞凍存管，然后在超凈工作臺(tái)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL無(wú)菌離心管，500g，室溫離心5min。
2.棄血清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
3.將細(xì)胞接種于合適的細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，然后置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.次日觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，如有異常現(xiàn)象，例如污染，細(xì)胞狀態(tài)差等，請(qǐng)拍照留證并及時(shí)與技術(shù)支持聯(lián)系。
5.根據(jù)細(xì)胞習(xí)性及時(shí)換液、傳代、凍存細(xì)胞。
干冰運(yùn)輸細(xì)胞
1.將細(xì)胞從干冰中取出后立即置于37°C水浴，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)凍存管，直至管內(nèi)細(xì)胞完全融化（最好在1～2min內(nèi)解凍）。
2.將凍存管轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，用75%酒精徹底消毒凍存管。
三、細(xì)胞培養(yǎng)
1、細(xì)胞復(fù)蘇將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37°C水浴中快速搖晃至溶解，然后在超凈工作臺(tái)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL無(wú)菌離心管，加入4mL培養(yǎng)基或無(wú)菌PBS混合均勻，室溫，500g，離心5min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液并檢查細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
2、細(xì)胞傳代
貼壁細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度約80%時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)：吸出原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加2~3mL0.25%胰酶進(jìn)行消化（注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間）。
鏡下觀(guān)察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)（可用吸管吸起些許胰酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見(jiàn)細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀(guān)察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）直接吸掉胰酶，加3~4mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
懸浮細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度約80%時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)：直接將原培養(yǎng)液和細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移至15mL或50mL無(wú)菌離心管，400～500g室溫離心5min，吸掉培養(yǎng)基，用新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性，按合適比例傳代細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、細(xì)胞凍存收集細(xì)胞，500g，離心5min，棄上清液，加入無(wú)血清凍存液輕輕懸浮細(xì)胞，移入凍存管后進(jìn)行凍存。
使用須知
1.本產(chǎn)品僅供購(gòu)買(mǎi)方單方使用，不得向任何第三方贈(zèng)送、轉(zhuǎn)讓或銷(xiāo)售；
2.本產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室和體外研究使用，不能用于任何臨床檢驗(yàn)、診斷、治療，或任何非法用途；
3.收貨48h內(nèi)如若發(fā)現(xiàn)異常，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系售后，逾期視為收貨良好；
4.請(qǐng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)操作，否則造成細(xì)胞失活等情形，不予提供補(bǔ)發(fā)服務(wù)。
