蛋白質(zhì)樣品的制備，是蛋白質(zhì)研究的第一步，不論后續(xù)采用何種分離或鑒定手段，樣品制備都是重要步驟。

蛋白質(zhì)樣品制備的意義

1. 生物的蛋白質(zhì)種類(lèi)多達(dá)10萬(wàn)種以上，樣品中的蛋白質(zhì)種類(lèi)也可達(dá)到1萬(wàn)種以上，但大部分蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)很少，因此通過(guò)樣品制備起到濃縮蛋白質(zhì)的作用。

2. 去除樣品中各種非蛋白質(zhì)的影響。

如何進(jìn)行蛋白質(zhì)的制備

蛋白樣品制備包括蛋白質(zhì)的分離，提取和純化。從各類(lèi)研究角度而言，樣品制備都要盡可能獲得所有樣品中的蛋白質(zhì)，但是由于蛋白質(zhì)種類(lèi)多，豐度不一，物化特性多樣等因素，要到達(dá)真正的完全蛋白質(zhì)制備是非常困難的。

在制備中丟失的蛋白是永遠(yuǎn)不可能在后面試驗(yàn)中彌補(bǔ)回來(lái)的！

樣品制備的原則:

1. 盡可能采用簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行樣品的制備。

2. 盡可能提高樣品的溶解度，使所有待分析的蛋白質(zhì)樣品全部處于溶解狀態(tài)，且穩(wěn)定可重復(fù)。

3. 盡可能減少蛋白的降解。

4. 根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)選擇決定提取蛋白的方法，例如提取變性還是活性蛋白，提取總蛋白還是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分蛋白。

5. 盡量去除干擾下游應(yīng)用的雜質(zhì)，包括但不僅限于核酸，組織碎片，或某些高豐度無(wú)關(guān)蛋白。

樣品制備的基本流程：

1. 樣品的破碎

2. 樣品的裂解

3. 雜質(zhì)的去除及蛋白質(zhì)溶液的獲取

樣品的破碎

為了完全分析細(xì)胞內(nèi)蛋白，樣品必須經(jīng)過(guò)有效的破碎，破碎方法的選擇依賴(lài)于樣品來(lái)源不同（如組織，固定組織，難研磨組織，脂肪，菌體）而不同，同時(shí)也依賴(lài)于提取蛋白的類(lèi)型（如是獲取總蛋白還是特殊的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分）。

通常組織樣品和微生物樣品都需要進(jìn)行破碎處理，而細(xì)胞樣品不需要。破碎可以通過(guò)滲透，凍融，酶解，超聲，高壓，液氮研磨，機(jī)械勻漿，玻璃珠勻漿等方式完成。選擇破碎方式時(shí)也要考慮使用的裂解液配方是否可以完美的配合，以得到最佳的提取效果。提取總蛋白時(shí)需要盡量的破碎樣品釋放蛋白，而特殊的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離則需要根據(jù)提取方法采用合適的破碎方式。

提示：內(nèi)源性的蛋白酶通常存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞破碎時(shí)可能會(huì)釋放出來(lái)，導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的降解，從而影響下游實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此可在細(xì)胞裂解前添加蛋白酶抑制劑加以保護(hù)。

樣品的裂解

樣品裂解是指對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行增溶性溶解的過(guò)程，可通過(guò)破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)之間的相互作用完成。通常裂解液中會(huì)添加表面活性劑，不同的裂解液配方所能溶解和獲取的蛋白種類(lèi)和得率會(huì)有較大差別，所得到的蛋白譜也會(huì)不同，所以看似簡(jiǎn)單的樣品裂解卻是決定整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵點(diǎn)。優(yōu)質(zhì)的裂解液配方既能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)間的良好分離，又不影響下游實(shí)驗(yàn)。

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去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)獲取

蛋白樣品中的雜質(zhì)主要包括核酸，脂類(lèi)，組織碎片等，這些雜質(zhì)均會(huì)干擾下游實(shí)驗(yàn)。特別是核酸雜質(zhì)會(huì)增加樣品的粘度，可能會(huì)引起下游實(shí)驗(yàn)中凝膠孔堵塞，核酸與蛋白結(jié)合阻礙聚集，銀染或WB背景過(guò)高等問(wèn)題，所以需盡量去除雜質(zhì)。去除雜質(zhì)后即可獲得蛋白質(zhì)溶液。傳統(tǒng)的提取方法（如RIPA裂解液和溶液法提取的試劑盒）缺少有效的雜質(zhì)去除步驟，通過(guò)離心取上清的方式獲取的蛋白質(zhì)無(wú)法完全去除雜質(zhì)，且獲得的蛋白純度較低，同時(shí)也會(huì)損失較多蛋白質(zhì)，從而影響蛋白的提取質(zhì)量，改變樣品中真實(shí)的蛋白譜。新一代柱式總蛋白提取法突破了傳統(tǒng)方法的困境，利用離心管柱技術(shù)，可有效去除蛋白中的核酸雜質(zhì)，提高蛋白純度，配合優(yōu)化的裂解液配方，無(wú)蛋白丟失，一管式操作，可快速獲取高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品。降低下游檢測(cè)難度，提高數(shù)據(jù)真實(shí)性。

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離

大部分實(shí)驗(yàn)通�？梢杂每偟鞍捉M分進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析，但是涉及到某些低豐度蛋白或者蛋白細(xì)胞定位和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)研究時(shí)，則需要進(jìn)行樣品的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離，也就是將樣品中的蛋白分成幾個(gè)組分，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)的研究。根據(jù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞定位進(jìn)行分離，可分離細(xì)胞核，細(xì)胞膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體，高爾基體，溶酶體，內(nèi)體等結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量，降低檢測(cè)難度，還可以針對(duì)某一細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。傳統(tǒng)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離主要是將樣品勻漿后，進(jìn)行密度梯度離心分離不同組分，傳統(tǒng)提取方法操作步驟多而復(fù)雜，所需起始原料量極大，需使用超高速離心及配制密度梯度溶液，得率較低，失敗率高，使得下游實(shí)驗(yàn)困難增加，阻礙深入研究進(jìn)程。為了加速科研者在蛋白領(lǐng)域深入研究的腳步，打造了柱式法亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離平臺(tái)，配有全套的動(dòng)植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離工具，可分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體，線粒體，內(nèi)體，細(xì)胞膜，葉綠體，外泌體，微粒體，細(xì)胞核等，僅需極少的樣品，無(wú)需超高速離心，即可獲得高質(zhì)量的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

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