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感受態(tài)細(xì)胞的制備

發(fā)布時(shí)間：2021/12/16 9:20:34 閱讀次數(shù)：681

1.挑取適當(dāng)菌株的 E.coli 單菌落接種于 2ml SOB 培養(yǎng)液中，37℃搖床過(guò)夜。

2. 取 0.5-1ml 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到 50ml SOB 中，18℃劇烈震蕩，直到 A600達(dá)到 0.6。

3. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中，4℃ 4,000rpm/min 離心 10min。同時(shí)在冰浴上配置 TB 溶液。

4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。

5. 取 1ml 剛配的 TB 溶液打散菌體沉淀，再加入 15ml TB（1/3 體積的起始培養(yǎng)液），冰浴 10-15min，4℃ 4,000rpm/min 離心 10min。

6. 棄上清，沉淀重懸于 4ml TB（1/12.5 體積的起始培養(yǎng)液），冰浴 10min。

7. 加入 280ul DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴 10min。

8. 將菌液分裝于 EP 管中，-80℃或液氮凍存。

9. 取兩管感受態(tài)細(xì)胞分別加入 1μl無(wú)菌 ddH2O（陰性對(duì)照）和 1μl純質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照）進(jìn)行轉(zhuǎn)化（見(jiàn)后），以檢測(cè)感受態(tài)的質(zhì)量。陰性對(duì)照平板上應(yīng)該無(wú)菌落生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。

0.1MK-Pipes(pH6.7)的配制

稱取 3.02g Pipes 粉末溶于 80ml dd H2O 中，此時(shí)粉末不能完全溶解，用 10NKOH 或 KOH 固體調(diào)節(jié) PH 值，只有當(dāng) PH 接近 6.7 時(shí)粉末才能完全溶解，此時(shí)當(dāng)小心少量地加入 KOH 直至達(dá)到所需 PH 值。